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《内蒙古农业大学》 2003年
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禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株Vp0、Vp1、Vp3蛋白基因的克隆、表达与活性检测

张二芹  
【摘要】: 本研究用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株第8代传代毒(AEV-VRE_8)通过SPF鸡胚传代复壮,获得了AEV-VRE_9实验用病毒。根据已知AEV-1143株Vp0、Vp1、Vp3基因序列,首先设计了三对引物。分别扩增AEV-VRE_9 Vp0、Vp1、Vp3基因,将扩增的Vp0、Vp1、vp3基因分别克隆到pGEM-T Easy载体中。经测序后,与已知1143株同源性:VP0为95%、VP1为94%、VP3为93%。然后设计表达引物,将扩增Vp0、Vp1、Vp3再克隆到pGEM-T Easy载体中,此次设计引物分别在Vp0、Vp1基因5′端加入BglⅡ、NdeⅠ酶切位点和ATG,3′端分别加上XhoⅠ酶切位点和TTA。Vp3基因5′端加入BamHⅠ、NdeⅠ酶切位点和ATG,3′端加上SalⅠ酶切位点和TTA。然后再用BglⅡ、XhoⅠ对克隆的Vp0、Vp1基因质粒酶切,BamHⅠ、SalⅠ对克隆的Vp3基因进行酶切,回收Vp0、Vp1、Vp3基因片段插入到pGEX-4T-1表达载体内,对重组表达质粒进行酶切和PCR鉴定。将阳性重组子转化到大肠杆菌ER2566细菌内,用IPIG进行诱导表达蛋白,蛋白经电泳、纯化,然后用ELISA方法检测蛋白活性,Vp1蛋白活性相对高于Vp0、Vp3。最后,再将自制VP1板用自配试剂检测其活性,同时用自制板和国外试剂、国外ELISA试剂盒、琼脂扩散试验检测同样10份血清作比较,三组ELISA检测结果,其中有8份被检血清S/P(抗体水平)大于0.2,为阳性;2份被检血清为阴性。这一结果与琼脂扩散试验检测结果一致。说明表达VP1蛋白活性达到预期要求,可以用作AE的ELISA诊断。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

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