表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护效力的研究

【摘要】：鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管病毒（infection bronchitis virus IBV）引起的鸡的一种急性,高度接触性呼吸道传染病。根据病毒的不同组织嗜性，主要有肾型、腺胃型、呼吸道型、产蛋下降等临床症状病变型。目前国内外预防本病所用的疫苗大多数是弱毒疫苗，但现用弱毒疫苗都存在以下缺点：（1）与IBV强毒一样，其弱毒疫苗株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终生带毒；（2）疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡群之间传播过程中毒力会返强，从而成为新的感染源；（3）传染性支气管炎病毒极易发生变异，且易成为病毒重组的供体和受体，给使用IB传统疫苗预防和根除IB带来极大的困难。因此，研究新型安全且有效的疫苗用于IB的防制十分必要。 S1糖蛋白是IBV的主要保护性抗原，它主要诱导机体产生体液保护性免疫应答。根据已经发表的IBV XJ3株的S1基因序列，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室刘胜旺研究员设计的一对特异性引物，通过PCR方法扩增了IBV XJ3株的S1基因，并克隆到pUC119质粒的BamHI酶切位点中。序列分析结果表明克隆的片段含有1659bp核苷酸，包含了完整的S1基因阅读框架。将克隆在pUC119中的S1基因和大肠杆菌的LacZ基因分别亚克隆到禽痘病毒转移质粒中，然后，将其通过脂质体方法转染由鸡痘病毒S-FPV-017疫苗株感染的SPF鸡胚成纤维细胞中，通过兰斑筛选出重组鸡痘病毒（rFPV-IBVS1），并对其进行了14轮蚀斑纯化。该重组病毒通过PCR方法鉴定证明,其基因组中含有完整的IBV S1基因；Western-blot实验也证明了该重组病毒在其感染的SPF鸡胚成纤维细胞中真实的表达了IBV S1糖蛋白。 用重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1等接种4周龄的SPF鸡进行的免疫及攻毒保护试验共设立4组（每组16只鸡）：第1组点眼免疫商品化IBV弱毒疫苗；第2组翅皮下注射免疫rFPV-IBVS1；第3组翅皮下注射免疫S-FPV-017弱毒疫苗；第4组为非免疫对照组。所有组的鸡在第一次免疫后4周以致死剂量的IBV XJ3株进行点眼、滴鼻、喉内接种攻毒。攻毒后的结果显示所有含rFPV-IBVS1免疫组的SPF鸡均100%保护而免于死亡；IBV弱毒疫苗免疫的SPF鸡也获100%保护，免疫以后的抗体跟踪检测证明rFPV-IBVS1诱导的抗IBV抗体水平低于IBV弱毒疫苗免疫组；攻毒后进行的IBV分离和PCR检测结果表明IBV弱毒疫苗免疫的SPF鸡能够更好地阻止攻击强毒的感染。 综合以上实验结果，重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1可诱导体液免疫，保护机体抵抗强毒的攻击。该重组鸡痘病毒与现用弱毒疫苗具有同等的免疫效力，但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感染，不会散毒。因此，本实验研究的rFPV-IBVS1疫苗将有希望从根本上取代现用的IBV弱毒疫苗，彻底改变IB防制现状。