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大骨鸡、青壳蛋鸡成纤维细胞库的建立及生物学特性研究

跃华  
【摘要】: 本论文选取了大骨鸡、青壳蛋鸡等我国地方品种鸡为研究对象,各品种取8日胚胎,采用组织块细胞贴壁培养法,分别成功地构建了上述2个鸡品种成纤维细胞库,根据建库要求对所建细胞系进行生物学分析,大骨鸡和青壳蛋鸡两个品种的冻存样本含量为各19个个体和9个个体,冻存管数是91支和42支,每个个体的冻存管数为4支以上,每支冻存管的细胞数量为2~3×106个细胞/ml.试验结果如下: 1.培养细胞形态为典型的成纤维状,为梭形或不规则三角形,细胞在生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走形。通过显微镜可观察到,不同种类、不同品种间细胞形态存在差异。 2.生长曲线结果显示,所培养细胞在体外的生长增殖过程中呈“S”型,经历了潜伏期、指数增生期和平顶期三个阶段,符合细胞在体外生长的一般规律。 3.细胞冻存前后存活率结果表明,细胞复苏后活率较冻存前有所下降,这表明细胞在冷冻、复苏过程中可能受到一定的损伤。但活率均在90%以上。贴壁后的细胞与冻存前相比,细胞类型更纯,完全为成纤维细胞,传代后细胞生长速度与冻存前基本一致。 4.在对所建细胞系进行微生物检测时,我们对细胞污染中常见的细菌、真菌、病毒及支原体污染进行分析,结果均为阴性,表明培养物未受到细菌、真菌、病毒及支原体的污染。 5.染色体分析得出:大骨鸡与青壳蛋鸡二倍体染色体数目2n=78,未见异常,遗传性能稳定,不存在种间的交叉污染。通过对染色体的核型分析,可进行物种的鉴定。 6.实验证明,lipofectin能有效介导重组质粒pECFP-N1转染成纤维细胞,转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间相关。当细胞汇合度达50~60%时,用4μl脂质体介导2μg重组质粒转染10h即可获得较满意的转染效率。转染率分别为大骨鸡28%,本青壳蛋鸡32%。 7.同工酶分析已被广泛的应用于物种分析,因此本实验对所建细胞系进行了乳酸脱氢酶(LDH)与苹果酸脱氢酶(MDH)的酶谱分析,表明不同物种各呈现其独特的条带,具有种属特异性。通过比较研究,得出细胞系之间不存在交叉污染的现象。实验所构建的成纤维细胞系符合ATCC的要求,成功的构建了两种地方鸡的成纤维细胞系,达到了畜禽遗传资源在细胞水平上的长久保存的目的,并为多方面的科学研究提供了宝贵实验材料。


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