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《内蒙古农业大学》 2007年
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红曲霉遗传转化方法研究及色素、桔霉素的研究

张垸帼  
【摘要】: 红曲霉的应用在我国有着悠久的历史。如今,红曲产品广泛地应用在酿酒、食品色素及保健药品等领域。其中,对红曲霉在医药保健方面的应用的研究近年来已成为国内外学者的研究热点。但在1995年,红曲霉中的一种有害代谢产物——桔霉素的发现引起了国内外学者的广泛关注。在欧美各国,桔霉素是食品或饲料中严加控制的毒素之一。 为敲除红曲桔霉素合成酶编码基因,构建不产桔霉素的红曲霉种打下基础,本课题对红曲霉原生质体的制备方法及红曲霉9903A的REMI原生质体转化方法进行了较为详细的研究。重点考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上32℃培养50-60h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:0.4% lysing enzyme、0.8% cellulase和0.6% snailase的酶组合,31℃作用1.5h;最适渗透压稳定剂是:1mol /L山梨醇。最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol/L蔗糖的RM2培养基。通过原生质体制备方法的研究,可显著提高原生质体的再生率。 本文利用PCR方法从红曲霉9903A菌株染色体扩增出包括ITS1、ITS2的部分序列和5.8S rDNA完整序列的保守系列,通过序列测定及比对分析确认该菌种为紫色红曲霉。用质粒pBC-Hygro进行原生质体转化。转化试验表明,所建立的转化方法可达到将外源基因转化到红曲霉中去的目的。经多次转化在潮霉素B抗性平板上共获得598株转化子,从中挑选色价与原菌株相当和提高的6株转化子进行固态发酵和稳定性的研究。经初筛和复筛,最终获得了色价显著提高的转化子ZM0303。 在进行上述原生质体制备和转化试验的同时,本课题以提高红曲产品色价和降低桔霉素含量为目标,对红曲霉的培养基和发酵条件的优化进行了大量探索性研究。通过单因素试验和正交试验确定了红曲霉固态发酵的培养基组成。还发现在培养基中添加适量硫酸镁、辛酸可以提高发酵液的色价并同时降低桔霉素的含量。在固态发酵工艺方面还研究了培养温度,发现在一定温度范围内(30-36℃)红曲米的色价随着温度的上升而增加,温度偏低(30℃)时,红曲米桔霉素含量显著减少。培养过程中较低的加水量有利于红曲霉产色素。最优的固态发酵条件是种子发酵液R3及pH3.5,大米60g,接种量为45%,大米中添加ZnSO4 0.2%、辛酸0.05%,固态米中加入水pH4.0。在优化条件及初始条件下对转化菌株ZM0303进行固态发酵,在整个发酵过程中,ZM0303的色价稳定提高246.3%,色价与桔霉素含量比值提高了348.12%。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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