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北京油鸡部分重要形状基因克隆及purh基因3种表达载体构建

包阿东  
【摘要】: 利用RT-PCR方法扩增PURH、CD3δ、CD3ε、CD8α、IFNαreceptor1、IFNαreceptor2、IFNγreceptor2、RBMX、PEPD、WRB等10个基因。采用组织块贴壁培养法,成功地构建北京鸡成纤维靶细胞系。提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA,检测PURH基因mRNA的差异表达水平。将PURH基因完整开放阅读框重组至真核表达载体pEGFP-N3,pEYFP-N1及pDsRed1-N1,成功构建带有报告基因的3种真核重组表达载体。脂质体介导导入北京油鸡体外培养成纤维细胞中,对PURH基因的时空表达、亚细胞定位、阳性细胞生长、增殖状况、细胞活力以及提高基因表达率的最佳方法等方面进行了深入的研究;并利用G418药物筛选和对荧光强度高的单克隆化培养。实验结果如下: 1.将10个基因侧序后提交Genbank。 2.根据ATCC的细胞库鉴定内容与评价标准,对所构建细胞系进行了生物学性状研究、鉴定和综合评价,所得结果显示未发生物种间细胞的交叉污染和恶性转化,遗传性能稳定。 3.在转染后24、48和72h,重组融合蛋白转染率在10.3%-53.2%之间。pEGFP-N3-PURH,pEYFP-N1-PURH与pDsRed1-N1-PURH在北京油鸡成纤维细胞的细胞核与细胞质均有分布,呈弥散分布。经药物筛选和单克隆化培养,获得表达pEGFP-N3-PURH,pEYFP-N1-PURH与pDsRed1-N1-PURH融合蛋白的阳性克隆细胞株,经RT-PCR扩增与Western blot检测确认了PURH融合蛋白基因已经整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中,获得正常表达。


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