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《内蒙古农业大学》 2009年
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JSRV检测及JSRV转录起始调节基因LTR致瘤机制相关性研究

罗军荣  
【摘要】: 绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是一种绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)导致的肺腺泡样肿瘤性疾病,病原JSRV为β-反转录病毒,国际兽疫局(OIE)将该病列为B类传染病。在国内,该病目前主要依靠常规病理学方法检测诊断,严重障碍了我国OPA的快速诊断和防控,同时,对绵羊肺腺瘤病的发病机理尚有很多不清楚的地方。 为了进一步研究JSRV的致病机制及建立快速诊断OPA的方法,本研究在绵羊肺腺瘤病流行病学﹑病理学研究的基础上,以获得的3株抗JSRV-CA蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用Western blot进行肽探针扫描,以鉴定三株单抗识别的线性表位;并应用非竞争性ELISA法测定三株单抗的功能性亲和常数,筛选合适的单抗,用于建立基于JSRV-CA的血清学诊断法。 以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本,比较阴性﹑阳性样本对JSRV-CA重组蛋白与抗JSRV-CA单抗的阻断率的差异,首次在国内建立了绵羊肺腺瘤病的阻断ELISA方法,并对该方法的特异性及临床应用作了检测。同时,应用生物学软件ClustalW(1.8)对内源性JSRV(enJSRV)与外源性JSRV(exJSRV)进行序列对比,针对两者差异显著的LTRU3区设计了特异性引物,在国内首次建立了特异性PCR及套式PCR检测exJSRV的方法。在700ng健康羊基因组DNA的背景下,梯度稀释阳性质粒pJSRV LTR为参照,对两种PCR方法的敏感性进行比较,并以建立的方法对临床病料进行检测。 为研究JSRV转录起始/调节基因(LTR)与病毒致瘤机制的相关性,需高纯度、高活力的肺泡Ⅱ型上皮细胞及enJSRV/exJSRV LTR作为研究材料。本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离并纯化了山羊肺泡Ⅱ型上皮细胞,并应用碱性磷酸酶(AKP)结合核固红染色鉴定细胞的纯度,应用台盼蓝检测细胞的活力。此外,克隆了JSRV的内外源性LTR,并对其结构进行了分析。用生物学软件DNAstar﹑MatInspector比较了LTR U3区的同源性及细胞转录因子结合位点的差异,并基于U3区的核苷酸序列,用生物学软件Mega绘制了JSRV LTR系统遗传进化树。在获得了肺泡Ⅱ型上皮细胞及enJSRV/exJSRV LTR的基础上,应用双萤光素酶报告基因技术,比较了绵羊﹑山羊enJSRV LTR与绵羊exJSRV LTR在不同细胞内的启动子活性。此外,分别缺失突变了LTR的Gfi-Ⅰ﹑C/EBP﹑HNF-3β等三个转录因子结合位点,比较了绵羊exJSRV LTR与突变后exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内启动子活性的差异。 实验结果为:⑴本研究建立的ELISA法以阻断率为37%作为阴性与阳性判断的临界点,可以明确区分感染JSRV的阳性病料与健康阴性对照。所建立的PCR检测方法中,套式法的敏感性是一步法的10倍以上,可检测出样本中1~10拷贝的JSRV,同步检测结果表明,以上的血清学和PCR检测方法与临床病理组织学诊断的结果高度一致。⑵本研究分离纯化的肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度为90%以上(AKP染色法),活细胞为95%以上(台盼蓝染色法)。⑶将本研究克隆测序的enJSRV/exJSRV LTR与GenBank上发表的其它JSRV LTR序列进行了系统遗传进化树分析,表明本研究克隆的enJSRV/exJSRV LTR分支明显,且现有的enJSRV/exJSRV LTR在病毒与宿主共进化的过程中分别演化出2个不同的分支。本研究克隆的我国内蒙古地区JSRV流行株与欧美毒株有较近的亲缘关系。⑷双荧光素酶分析试验表明,除肺泡Ⅱ型上皮细胞外,enJSRV/exJSRV LTR在各细胞内的启动子活性差异较小,而exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内相对活性为其他细胞内相对活性的24-230倍。分别缺失突变C/EBP﹑HNF-3β转录因子结合位点的绵羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的启动子活性下降约60%-70%。 以上结果表明:JSRV病毒粒子及exJSRV序列在肺肿瘤组织中含量高,是临床实验室检测的理想材料,而外周血白细胞中亦含有exJSRV序列,需用高敏感的套式PCR作检测。exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内表现出高活性,说明绵羊exJSRV LTR对肺泡Ⅱ型上皮细胞具有特殊嗜性。此外,缺失转录因子C/EBP﹑HNF-3β结合位点显著影响绵羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的启动子活性,说明这两个转录因子结合位点对绵羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内的特殊嗜性具有重要作用。 本研究建立的特异性实验室检测JSRV方法,对于我国养羊业的健康发展,具有重要的理论价值和实用价值。另外,JSRV LTR致瘤相关性研究对于丰富JSRV的分子发病机理以及研究OPA防制措施等均有重要意义。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S858.26

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘霄卉;JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备[D];内蒙古农业大学;2011年
【参考文献】
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【共引文献】
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3 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
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7 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
8 方忠意;崔保安;;动物基因工程疫苗研究进展[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
9 曾政;任远志;叶昭辉;凌洪权;杨泽林;熊仲良;;重庆市2009年犬狂犬病检测及流行病学调查[A];重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2009年
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4 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
5 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 黄馨;端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生[D];北京协和医学院;2010年
7 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
8 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
9 孙亚妮;免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D];山东农业大学;2011年
10 邱玉玉;A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备和不同亚群禽白血病病毒共感染相互影响的研究[D];山东农业大学;2011年
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2 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
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4 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
5 许莹;H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究[D];南京医科大学;2010年
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7 史平玲;猪FcγRⅢ介导PRRSV抗体依赖增强作用研究[D];郑州大学;2010年
8 巩艳艳;抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的变异[D];山东农业大学;2010年
9 裴兰英;HSP_(70)与MDV肿瘤的发生发展相关性研究[D];山东农业大学;2010年
10 薛梅;潍坊地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 么宏强;绵羊肺腺瘤病自然病例和人工感染病例的临床病理学及分子病理学研究[D];内蒙古农业大学;2006年
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【二级引证文献】
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1 李靖;瓦西力;周艳喜;么宏强;于立新;敖威华;马学恩;;绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达[J];动物医学进展;2012年07期
【二级参考文献】
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1 刘淑英;绵羊肺腺瘤病毒NM株基因组全序列的研究[D];内蒙古农业大学;2004年
2 么宏强;绵羊肺腺瘤病自然病例和人工感染病例的临床病理学及分子病理学研究[D];内蒙古农业大学;2006年
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10 罗文永,李晓方,肖昕,毛兴学,刘彦卓;一种简单快速的DNA模板制备方法[J];种子;2002年05期
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9 记者 张平阳 杨斌鹄;快速检测甲流 西安批量生产关键设备[N];西安日报;2009年
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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2 刘新军;表达布氏杆菌sodc基因的重组沙门氏菌的构建及不同种布氏杆菌鉴别PCR检测方法的建立[D];华中农业大学;2010年
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5 刘志国;实时多重荧光PCR快速鉴别布鲁菌方法的建立[D];内蒙古农业大学;2010年
6 郑升博;猪链球菌多重PCR检测方法的建立及屠宰场样品感染率的调查研究[D];上海交通大学;2010年
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8 陈晶晶;不同纳米材料对PCR优化作用的研究及机制探讨[D];东华大学;2011年
9 谭景尹;PCR—膜芯片~(?)技术检测结核杆菌耐药基因突变的应用研究[D];广西医科大学;2011年
10 王文娟;食源性致病菌多重PCR检测试剂盒的研制与应用[D];山东农业大学;2011年
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