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《内蒙古农业大学》 2010年
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荧光定量PCR检测禽白血病病毒与RNA干扰抑制J亚群禽白血病病毒复制的研究

张在平  
【摘要】: 禽白血病(Avain leukosis,AL )是由禽C型反转录病毒引起禽类多种肿瘤性疾病的总称。禽白血病在临床上感染率很高且危害严重,到目前为止,还没有合适的疫苗和有效的药物进行防治,国内外控制该病均从建立无禽白血病的净化鸡群及选育对本病有抵抗力的鸡群着手,常用RT-PCR和ELISA试剂盒检测病毒来淘汰阳性鸡,RT-PCR检测的灵敏度较低,而且容易污染,常常有漏检或假阳性结果的出现,不适用于鸡场大规模的检测;ELISA是比较常用的一种检测方法,但由于我国目前还没有成型的检测试剂盒上市,进口试剂盒价格昂贵,一般的鸡场难以施行,因此发展一种切实可行的防治该病的方法势在必行。 Yongbaek Kim等利用实时荧光探针RT-PCR对J亚群病毒RNA定量化,同时将其结果与(Qc)-RT-PCR、传统定量法和抗原ELISA法进行了比较,发现实时荧光定量RT-PCR法特异性强、易于操作、重复性好。此方法可用于该病的早期诊断。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物体对抗外来基因入侵的一种保护机制。它是一种由双链RNA(dsRNA)诱导的转录后基因特异性沉默现象。已经证明其在细胞及动物水平均能有效抑制病毒的复制和抑制病毒感染靶细胞,siRNA对病毒的干扰作用具有高效、特异的特点,为抗病毒研究提供新的思路。 本研究首先建立了Real-time PCR检测禽白血病病毒的方法,此方法与RT-PCR和ELISA法相比,灵敏度高、特异性强和重复性好,临床样品检测稳定可靠,为该病早期诊断奠定基础。本研究以ALV-J gag、pol、env基因为靶标,根据miRNA设计原则,设计并合成了13对miRNAs序列,克隆到真核表达载体pcDNA6.2,通过脂质体转染DF-1细胞,转染后24h内接种ALV-J,于接毒后120h通过间接免疫荧光(IFA)检测病毒囊膜糖蛋白表达,于接毒后72h收集细胞及其上清液,通过Western-blot检测病毒囊膜糖蛋白表达并通过Real-time PCR检测病毒RNA的拷贝数。通过上述实验来评价miRNA是否对ALV-J的复制具有抑制作用。由于大多数病毒可以通过选择突变来逃避RNAi介导的抗病毒作用,为了抵抗病毒的这种选择突变和逃逸,本研究运用多靶点串联策略,构建了多靶点串联miRNA表达载体,在细胞水平验证其是否具有协同抑制病毒复制的作用。实验结果表明,筛选到了能有效抑制ALV-J复制的靶点,gag基因2个,pol基因3个,env基因2个,抑制病毒复制的效率为17.5%~86.0%;成功构建了多靶点串联miRNA表达载体,并在细胞水平证明了其具有协同抑制该病毒复制的作用,抑制病毒复制的效率高达85.0%~91.2%,说明多个miRNA串联策略可能具有抵抗病毒的选择突变和变异。
【学位授予单位】:内蒙古农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.65

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