小麦赤霉病菌DON毒素及其降解基因Tri101的克隆和遗传转化研究

【摘要】： 赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由镰刀菌引起的谷类作物病害之一,其产生的单族毒素对人、畜毒性大,可引起多种中毒症状。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium Schwabe) Tri101基因编码的单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶通过加乙酰基的形式使单族毒素降解为低毒物质。本文研究了禾谷镰刀菌的DON毒素及其降解基因Tri101的克隆、表达和在小麦中的遗传转化,为作物脱毒和有效防治赤霉病奠定理论基础,为经济、安全和高效净化食物和饲料中真菌毒素提供科学依据。主要包括: 1.野生型禾谷镰刀菌0623(F. graminearum 0623,简称Fg0623)在PDA平板上28℃分别培养3d、5d、7d,气生菌丝生长旺盛,中心菌丝在培养第7d开始老化;菌落基质由白色变为红色,部分基质呈深红色;在绿豆汤培养基中25℃、180rpm振动培养3d时,其镰刀状孢子清晰可见。在小麦培养基上25℃分别培养10d、20d、30d、40d、50d,高效液相色谱法测定DON的含量,结果显示DON产量与培养时间呈近似抛物线型关系,在30d时最高,30d后迅速下降。 2.利用RT-PCR克隆Fg0623的Tri101基因cDNA片段并测序,Tri101基因核苷酸序列阅读框架全长1 356bp(GenBank序列号:GQ907236),编码451个氨基酸的多肽,推测分子量为49.45 kDa,等电点为5.14。氨基酸序列同源性比对结果表明,它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高,为99.56%,与其它13种镰刀菌的Tri101氨基酸序列同源性分别为97.91%~75.68%。系统进化树分析结果表明,Fg0623与F. sporotrichioides属于同一进化枝且与F. asiaticum有较近的亲缘关系,而与F. oxysporum、F. moniliforme、F. nygamai、F. nisikadoi和F. decemcellulare的亲缘关系较远。 3.构建的原核表达载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,Tri101基因在BL21中高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价为1: 256 000,Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。 4.采用农杆菌介导的小麦生长点转化法将pCAMBIA1301-Tri101-EHA105转入小麦品种豫麦18、郑麦366和郑麦9962中。100mg/L潮霉素筛选后的转化植株用PCR进一步验证,获得T0代小麦植株分别为32、15和29株,GUS染色结果显示有蓝色位点,证明Tri101基因已经整合进小麦基因组中并成功表达。