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《大连理工大学》 2010年
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百合双价抗病毒载体的构建及遗传转化的研究

白建芳  
【摘要】: 百合病毒病能导致切花品质低下、种球退化严重,可给百合种植业带来较大的危害,目前已成为亟待解决的世界性难题。目前,RNA介导的病毒抗性研究为百合的抗病毒工程提供了有力的理论基础。本研究首先从感染了百合无症病毒(LSV)和百合斑驳病毒(LMoV)的百合叶片中分别提取总RNA,并以此为模板利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别扩增出439 bp的LSV CP基因和376 bp的LMoV CP基因片段。然后利用重叠延伸PCR技术获得LSV-LMoV融合的基因片段。应用Gateway基因克隆技术将此LSV-LMoV融合基因片段,通过BP反应克隆到入门载体pDONR201,再通过LR反应将目的片段反向重复亚克隆到植物表达载体pH7GWIWG2 (Ⅱ),获得了抗病毒植物表达载体pH7GWIWG2 (Ⅱ) -LSV-LMoV。 为了研究表达载体在转基因百合体内的表达情况,本文建立了转基因百合的LSV-LMoV实时定量PCR检测方法。首先利用基因克隆技术,对百合常用的4个内参基因Actin、18s rRNA、EF-1α-1和EF-1α-2分别进行了克隆,然后利用实时定量PCR技术对他们的表达量进行检测。Rotor-gene软件的分析结果表明,Actin基因在不同百合品种的不同组织中表达都比较稳定,确定其可以作为定量分析的内参基因。 以“索邦”和“白天堂”百合的无菌子球鳞片为转化受体材料,根癌农杆菌EHA105为转化菌株,潮霉素基为筛选标记基因。利用RNA介导的病毒抗性的机制,将植物表达载体pH7GWIWG2 (Ⅱ)-LSV-LMoV对百合苗进行了遗传转化。利用RT-PCR及实时定量PCR技术对78株“索邦”,和69株“白天堂”转基因百合进行检测,结果表明,转化的“索邦”百合中有17株为阳性苗,“白天堂”百合中有6株为阳性苗,据此确定获得了RNA介导的百合抗性植株,但对病毒的抗病能力有待进一步研究。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S682.29

【参考文献】
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