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《大连理工大学》 2010年
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蛋白A的重组表达及重组菌的发酵过程优化

林雪  
【摘要】: 金黄色葡萄球菌蛋白A,简称蛋白A(Staphylococcus aureus protein A, SPA)能够特异性地与多种哺乳动物抗体结合,在抗体分析、分离以及医学领域有广泛的应用。但金黄色葡萄球菌为致病菌,蛋白A为细胞壁结合蛋白,因此,通过规模化培养金黄色葡萄球菌的方法获取蛋白A不仅有一定风险,且分离纯化也有一定难度。 本论文的工作目标是研究利用基因工程技术生产重组蛋白A的方法。研究内容包括表达蛋白A的基因工程菌的构建以及培养条件(包括摇瓶和发酵罐培养)的优化。 论文首先选择原核表达系统进行研究。选用大肠杆菌作为表达宿主菌,pET系列质粒作为表达载体,选择含有抗体结合域的不同长度的蛋白A编码基因进行基因构建。分别获得了四种不同分子量蛋白A的胞内表达,发现spa4的表达量最大,且与IgG结合活性良好,因此,选择该表达菌株进行后续研究。分别在摇瓶和发酵罐中进行了培养条件和诱导条件的优化。在摇瓶培养中,对诱导剂加入时间和加入量进行了初步优化,发现在菌体培养1~6小时时间段内,随着诱导剂加入时间的延后,工程菌的生长密度逐渐增加,但单位菌体蛋白A的表达量相差不大。诱导剂IPTG和乳糖均能有效诱导蛋白A表达,但乳糖对菌体生长的抑制作用较弱。在5 L发酵罐中,利用指数流加的补料方式,对补料速率进行优化。获得优化的培养模式为:以300 g/L的葡萄糖、50g/L的酵母提取物作为补料培养基,以0.1 h-1为理论比生长速率计算补料速率,在菌体OD600nm达到60时加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG。在优化的条件下,最终发酵液的菌体密度OD60nm达70以上,重组蛋白A表达量占菌体胞内总蛋白的比例约为22%,每升菌液重组蛋白A表达量约为2.6 g。 为了简化重组蛋白A分离纯化的难度和成本,论文进一步对能够实现蛋白A外泌表达的真核表达系统进行了研究。利用毕赤酵母作为表达宿主、pPIC9K作为表达载体、选择仅含抗体结合功能区的蛋白A编码基因成功构建了外泌表达蛋白A的基因工程菌。在摇瓶培养中,考察了培养基组成,诱导剂甲醇加入量及诱导时间对重组蛋白A表达的影响。实验结果表明,利用BMGY/BMMY培养基,诱导阶段每24 h加入甲醇至终浓度0.5%,诱导84 h,目标蛋白的表达量最大。所表达的重组蛋白A与人IgG结合活性良好。 通过本论文的研究,建立了重组蛋白A的原核和真核表达体系,对其培养和诱导条件进行了系统优化,研究结果为规模化生产重组蛋白A奠定了基础。
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