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《大连理工大学》 2011年
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刺参腐皮综合症病原菌及其裂解性噬菌体的分离和鉴定

谭德猛  
【摘要】:“腐皮综合症”是刺参养殖中最常见,危害最为严重的疾病。当前,“腐皮综合症”的防治主要依赖消毒剂和抗生素,传统抗生素类药物的滥用易导致细菌抗药性的产生和药物残留等食品安全问题,因此急需研发一种新的防治刺参细菌性疾病的抗菌制剂。本实验拟从患“腐皮综合症”的刺参中分离一株致病菌,通过人工回接感染实验、生理生化指标和分子生物学手段鉴定该菌株;在此基础上以该致病菌为宿主菌筛选裂解性噬菌体,并考察噬菌体的生物学特性。 将患有“腐皮综合症”的刺参组织匀浆并稀释,涂布于选择性培养基中培养,挑取优势菌落培养、纯化后保存;经人工回接感染实验验证所得菌株的致病性;通过形态学、生理生化指标以及16S rDNA PCR技术分析鉴定该病原菌的种属。实验结果表明,分离纯化后的优势菌落颜色为玉米黄色,扁平且呈煎蛋型,不透明,无气味,不易挑起,菌落光滑且富有粘性,为革兰氏阴性短杆弧形,长约1~2μm,具有极生单鞭毛,其扫描电镜形态与弧菌属的形态特征相近。人工回接感染实验结果显示,体腔注射攻毒菌体剂量为5x103CFU可导致刺参吐肠;将刺参浸浴在菌体浓度为1×103CFU/ml的水体中,饲养第3天可引起刺参腐皮综合症的爆发。分离的致病菌能够分解代谢精氨酸、葡萄糖苷、苯丙氨酸、甘氨酸,不能分解代谢尿素、丙二酸、果糖、鸟氨酸、山梨醇及乙酸,与哈维氏弧菌的代谢特征极其相似。进一步将PCR扩增获得的16S rDNA片段(1436bp)进行系统发育树分析表明与哈维氏弧菌同源性可达99%。 采集刺参养殖场的废水,经离心、过滤处理得到噬菌体原液;将噬菌体原液接种到上述分离的对数生长期菌液中培养,过滤除菌,得到高效价噬菌体增值液。通过双层平板法分离纯化噬菌体。透射电镜观察噬菌体的形态特征,RFLP分析噬菌体基因组的指纹图谱,通过体外抑菌实验、一步生长曲线、宿主菌对噬菌体抗性研究以及噬菌体颗粒浓缩来阐述噬菌体的生物学特性。实验结果表明双层平板法获得大小不同的两种噬菌斑。透射电镜观察结果显示,分离的两株噬菌体(VP-1和VP-2)属于长尾噬菌体科(Siphoviridae)。RFLP实验表明,VP-1和VP-2的基因组为双链DNA。VP-2噬菌体的裂解周期为40min,一个裂解周期可以产生约100个子代噬菌体颗粒。宿主菌对VP-1和VP-2均能产生抗性,VP-1的裂解能力优于VP-2, VP-1和VP-2协同作用时,可以显著抑制病原菌的生长。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S947.9

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