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《大连理工大学》 2012年
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新型温敏膜的构建及其培养收获干细胞的研究

杨磊  
【摘要】:干细胞是—类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,其在组织工程、基因工程等生物医药领域起着举足轻重的作用。但来源于人或动物的组织或体液中的原始干细胞数量不足,很难满足临床应用的需要,因此需要构建干细胞的体外扩增体系。细胞在体外培养时会经历反复的接种-收获过程,酶解法依然广泛应用于细胞回收过程中。但是酶类物质的介入会导致细胞膜蛋白的损伤,而膜蛋白的变异会致使细胞功能障碍或功能缺失,这可能会削弱干细胞在治疗医学上的应用潜能。因此有必要选取更为合理的干细胞体外培养体系和回收方式。研究表明温敏性材料聚N-异丙基丙烯酰胺(poly (N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)可以替代酶类物质用于贴壁细胞的收获。采用PNIPAAm材料的降温脱附法可以更有效地保护细胞膜蛋白和相关受体,从而维护细胞的生理功能。如果将PNIPAAm材料的研发与干细胞的体外培养相结合,那么有望实现为组织工程提供优良种子细胞的目标。 首先合成了一种新型的以PNIPAAm为主体的共聚物,并对其温敏特性、化学结构、分子组成及分子量等进行了相关检测。以N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide, NIPAAm)、甲基丙烯酸羟丙酯(hydroxypropyl methacrylate, HPM)和甲基丙烯酸(3-三甲氧基硅)丙酯(3-trimethoxysilylpropyl methacrylate, TMSPM)为合成原料,以偶氮二异丁腈(2-azobisisobutyronitrile, AIBN)为引发剂,以无水乙醇为溶剂采用自由基聚合法合成了P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物。采用动态光散射仪确定了共聚物在水溶液中的温敏特性,及其最低临界溶液温度(lower critical solution temperature, LCST)为29℃;傅里叶变换红外光谱证实了共聚物中酰胺键,异丙基键,羟基,硅氧烷键,酯基等特征官能团的存在;核磁共振氢谱进而确定了总产物中三种反应物之间的摩尔比例,即NIPAAm:HPM:TMSPM=18:1:1;凝胶渗透色谱测定了终产物的分子量,即重均分子量Mw为192kD,数均分子量Mn为119kD,多分散性系数Mw/Mn为1.6,聚合度为45。结果表明所合成的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物具有温敏特性,但HPM和TMSPM的加入使LCST降低了2-3℃。 进而将合成的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物接枝聚合到含有羟基的基底上,从而形成一种新型的共聚物膜,并对其性能进行了相关检测。将P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物溶于无水乙醇,配置成不同浓度的共聚物溶液,然后采用旋转涂膜仪以相同的旋转速度和旋转时间在硅片和盖玻片上进行涂膜,在真空和高温条件下退火,经过无水乙醇和超纯水浸泡清洗后,室温下真空干燥。采用接触角测量仪,原子力显微镜和椭圆偏振仪分别测定了共聚物膜的表面接触角,表面形貌和总体厚度随温度及共聚物浓度的变化趋势。实验结果显示在给定浓度的干燥或湿润状态下,以共聚物浓度2mg·mL-1为分界点,共聚物膜上水的接触角随着共聚物浓度的增加呈现先增后降的趋势,而在相同浓度下,干膜上水的接触角高于湿膜上的接触角,并且20℃时的接触角要低于37℃时的接触角;随着共聚物浓度的增加,室温条件下共聚物干膜的厚度不断增加,其表面粗糙度也随之增大;超纯水中的共聚物膜在20℃会发生体积溶胀,而当温度升至37℃时,则呈现皱缩的状态,如果体系温度不断在20℃和37℃之间反复变化,共聚物膜则呈现可逆性的体积变化。上述变化规律和趋势表明共聚物颗粒已经通过硅氧烷键和羟基的键合而接枝到基底材料上,且完成了颗粒之间的链接。通过调节共聚物的浓度可以控制P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜的表面润湿性、表面结构和厚度,且该膜具备温敏性、可控性、可逆性和稳定性。 之后,将HeLa细胞、HEK293细胞和间充质干细胞等不同类型的细胞接种到P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜上,观察这些细胞在37℃和20℃时的粘附和脱附状态。结果表明不同细胞的生长和脱附对膜厚度及表面润湿性的要求不同,因此在将温敏性膜材料用于干细胞的培养和收获之前,有必要进行适宜膜的筛选。 最后,将骨髓及脂肪来源的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs或adipose-derived stem cells, ADSCs)培养在适合其生长和脱附的P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜和盖玻片上,用降温脱附法与胰酶消化法分别收获细胞,如此传代培养3次后,进行细胞活力、免疫表型、增殖能力、分化潜能及蛋白质残留情况等方面的检测。结果表明,两种方法收获的细胞在细胞形态、免疫表型、骨和软骨发生能力(BMMSCs)或脂肪发生能力(ADSCs)等方面并未展现明显的差异,但降温脱附法收获的细胞与对照组相比却具有更好的细胞活性,更强的增殖能力,更高的成脂肪分化能力(BMMSCs)或成骨和成软骨能力(ADSCs)以及更多的蛋白质残留。因此,P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物膜上培养干细胞并使用降温脱附收获细胞,在保持细胞增殖能力和维护细胞功能方面均优于传统胰酶消化法。 本研究制备了P(NIPAAm-co-HPM-co-TMSPM)共聚物和共聚物膜,并且成功地将它们应用于干细胞的培养和非酶解收获中,这为温敏性培养基底的制备以及干细胞的体外培养提供了新的思路和技术手段。如果将这种温敏膜制备于微载体或中空纤维膜上,再结合生物反应器技术,则有望形成新的体外大规模扩增干细胞的培养体系。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R329;Q813

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【参考文献】
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