骨髓间充质干细胞体外扩增及其与神经类细胞共培养的研究

【摘要】：中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病与损伤,如帕金森病(Parkinson's disease, PD)、脊髓损伤等比较难以自我修复,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植被认为是具有潜在应用价值的治疗手段,但NSCs来源困难。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)以其多分化潜能、可源于自体、免疫源性低、易扩增、能分泌多种细胞因子并参与细胞微环境的构建等优势,为CNS疾病与损伤的治疗提供了一个新的思路。本文旨在研究BMSCs扩增后通过与NSCs之间的相互作用促进PD体外实验细胞模型的修复,进一步为BMSCs移植治疗与修复CNS疾病与损伤提供相应的实验依据。 本文首先采用胶原凝胶、中空纤维膜(hollow fiber membranes, HFMs)和自行研发设计的气升式环流生物反应器(air-lift loop bioreactor, ALB),建立一种可使细胞免受剪切力损伤的三维动态扩增体系,将BMSCs在体外先行扩增。在扩增的过程中,通过取样检测吸光度及计细胞数,绘制细胞生长曲线,获得细胞扩增倍数；检测细胞代谢参数,确定细胞的新陈代谢状况；扩增7天后,检测细胞在支架内的活性,观察细胞在支架上的生长形态,获得细胞进一步增殖、分化、保持自身功能的能力；流式细胞仪分析细胞表面特异性蛋白表达,检测细胞多向分化潜能,鉴定所扩增的细胞。结果表明,初始密度为5×105cells·mL-1的BMSCs在此系统中扩增时代谢旺盛,一周后,动态条件下扩增约17倍,静态条件下扩增约13倍；扩增的细胞仍保持较高的活性,活率约为92%,且在支架内仍保持长梭形的贴壁生长形态,仍表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45,并仍具有较强的成骨、成软骨及成脂肪的多向分化能力；动态条件下扩增的细胞呈现出更加充分伸展的形态与较强的多向分化潜能。 将以上扩增的BMSCs与生长于支架内的NSCs进行短期静态共培养,考察BMSCs与三维条件下NSCs之间的相互作用。实验中采用优化的海藻酸钙胶珠制备工艺,包囊适宜密度的NSCs,待微囊化的NSCs长至一定大小的神经球时,与BMSCs进行共培养。共培养过程中观察神经球结构及BMSCs形态的变化；共培养结束后计算NSCs及BMSCs的增殖倍数,对增殖条件下共培养的NSCs表型和多向分化潜能以及BMSCs向NSCs或神经细胞分化进行免疫荧光染色鉴定；对分化条件下共培养的NSCs向不同神经细胞分化的能力进行流式细胞仪检测,对BMSCs向NSCs或神经细胞分化进行免疫荧光染色鉴定。结果表明,1.5%(wt%)的海藻酸钠溶液与3.5%(wt%)的CaCl2溶液凝胶化反应10min,以0.8x105cells·mL-1为初始密度包囊NSCs,制备直径约2mm的海藻酸钙胶珠,与BMSCs进行共培养是比较适宜的。BMSCs可使生长于支架内的NSCs迁出细胞球,对NSCs的增殖没有明显影响；但能够明显影响NSCs的分化,使其向少突胶质细胞分化的能力增加3倍,向星形胶质细胞分化的能力减弱1倍,而向神经元细胞分化的能力没有明显变化；NSCs可促进BMSCs向NSCs及星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元细胞分化,且在分化共培养时这种分化比例增加,分别由增殖共培养时的约8%,11%,6%及7%增加至约18%,25%,15%及11%。 根据上述BMSCs与NSCs之间的相互作用,本文进一步利用去血清诱导PC12细胞凋亡,建立PD体外实验细胞模型,将诱导凋亡的PC12细胞与NSCs及BMSCs以不同方式进行共培养,考察BMSCs在NSCs修复这一细胞凋亡模型中的作用。实验采用海藻酸钙胶珠或transwell小室作为共培养隔离手段,通过观察PC12细胞的形态,检测PC12细胞的存活率、细胞周期和培养基中胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF)的含量,确定BMSCs在NSCs保护去血清诱导PC12细胞凋亡中的作用。结果表明,NSCs通过分泌神经营养因子GDNF抑制了去血清诱导的PC12细胞的凋亡,使受损细胞的凋亡率由模型组的44.0%降低至24.3%,存活细胞处于G1期的百分数由模型组的79.9%降至53.1%,处于S期和G2期的百分数分别由模型组的15.3%和4.9%增加至35.5%和9.8%,与正常培养的PC12细胞所处周期没有较大差异,G1期细胞向S期和G2期过渡基本未受阻断,起到了神经保护作用；引入BMSCs后,两种干细胞通过相互促进向神经细胞方向分化,使培养体系中细胞分泌GDNF的量比单独NSCs作用时平均增加约33.4%,细胞分泌GDNF的能力明显增强,提高了对去血清诱导凋亡的PC12细胞的保护作用,使受损细胞的凋亡率由单独NSCs作用时的24.3%继续降低至15.1%,且存活细胞处于G1期、S期和G2期的百分数分别为53.3%,36.7%和10.3%,仍与正常培养的PC12细胞所处的周期没有较大差异。