基因工程菌BphAB_(LA-4)转化吲哚行为的研究

【摘要】：微生物单加氧酶和双加氧酶对吲哚的羟基化反应可以生成一种重要的染料靛蓝。具备这类功能的细胞色素P450单加氧酶及萘双加氧酶已有了广泛且深入的研究。但同样具备吲哚转靛蓝能力的联苯双加氧酶却没有详细的研究。本论文对联苯双加氧酶转化吲哚可行性、最佳条件、转化机理以及转化体系进行了研究。 吲哚分子的C2/C3可以与联苯双加氧酶大亚基BphAl LA-4活性中心的Fe(Ⅱ)结合,距离为4.7/4.6A,而联苯双加氧酶大亚基BphAl_LA-4活性中心Fe(Ⅱ)与其自然底物联苯分子C2/C3的结合距离为3.6/4.1A,两者相差无几。同时,吲哚分子吡咯环的N原子可以与BphAl LA-4活性中心的氨基酸残基Gln-231和Asp-235形成氢键,保证了吲哚分子与酶分子的结合更加稳固。 将菌株Dyella ginsengisoli LA-4表达联苯双加氧酶和联苯-2,3-二氢二醇脱氢酶的基因片段bphAB克隆到表达载体pBR322上,导入Escherichia. coli BL21中异源表达,得到了基因工程菌BphAB_LA-4。BphAB LA-4休眠细胞具有转化吲哚的能力,但活性较低。优化诱导条件发现,当诱导温度为15℃,IPTG的浓度为0.25mM,培养基为寡营养培养基M9时,转化12h后,休眠细胞对吲哚的转化率最大,达到95%。SDS-PAGE验证了转化活性的提高时,BphAB_LA-4休眠细胞粗酶中可溶性蛋白的量也明显增加,尤其是大亚基BphAl LA-4更多的出现在粗酶上清中。 BphAl LA-4休眠细胞转化吲哚的最佳转化条件为生物量0.28g/L,吲哚浓度200mg/L,葡萄糖浓度0.2%,在此条件下反应10h后,靛蓝最大产量为44mg/L,其产率为0.16mg/mg CDW(CDW:细胞干重)。利用HPLC-MS鉴定转化产物主要包括靛红、靛蓝、靛玉红,其中靛蓝是主产物。推测其转化机理为：吲哚在BphA的作用下生成吲哚-2,3-二氢二醇,其转化过程需要的电子由大肠杆菌中的葡萄糖脱氢酶与葡萄糖反应不断提供。吲哚-2,3-二氢二醇在BphB的作用下生成靛红、自发脱水生成3-羟基吲哚,靛红与3-羟基吲哚在空气中氧化聚合形成靛玉红。同时,3-羟基吲哚自发聚合生成靛蓝。 本文尝试三种不同固定化方法将基因工程菌BphAB_LA-4固定,其中海藻酸钠包埋法取得了最好的效果,最佳包埋条件为3.5%(w/v)海藻酸钠,1%(w/v)氯化钙,固定化细胞在有机-水两相体系中可以重复利用两次,首次转化6h后,靛蓝浓度为15.9mg/L另外,两相体系的引入有效避免了固定化细胞产靛蓝过程中伴随的产物分解现象,选择正十二烷作为有机相,优化得到其最佳比例为40%(v/v)。体系对吲哚的最佳耐受浓度为400mg/L,在此条件下,靛蓝产率为0.28mg/mg CDW。