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《大连理工大学》 2012年
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普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体的研究

窦柏蕊  
【摘要】:以普鲁兰多糖为骨架,合成一种新型的非病毒基因载体P-PEI,另一方面,鉴于绝大多数肿瘤细胞表面叶酸受体过量表达,在P-PEI基础上合成了另一种具有叶酸靶向性的载体P-PEI-FA,并研究两种载体的性能。 1.载体的合成和表征 通过琥珀酸酐将低分子量枝化聚乙烯亚胺(PEI,1kDa)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上,合成了新型基因载体P-PEI,并进一步通过叶酸(Folic acid, FA)进行靶向性修饰,合成另一种载体P-PEI-FA。利用1H NMR和FTIR对合成的载体进行表征,结果表明成功合成了载体P-PEI和P-PEI-FA。TEM、 FESEM和缓冲能力测试表明,空载体具有良好的运载外源DNA或RNA的性能。 2.载体/pDNA复合物的性能研究 粒径及ζ-电位分析结果显示不同N/P的P-PEI/pDNA和P-PEI-FA/pDNA复合物粒径均在30-250nm之间,ζ-电位在12-35mV之间。凝胶阻滞实验证明载体P-PEI和P-PEI-FA在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA,并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解。MTT结果显示载体P-PEI/pDNA和P-PEI-FA/pDNA在N/P高达12.5时对HeLa、MCF-7、COS-7和Hep G2的细胞毒性仍较低,与PEI/pDNA相比显示了低的细胞毒性。体外转染实验结果表明,P-PEI和P-PEI-FA在N/P比为6.25时能有效将表达绿色荧光蛋白基因(pEGFP)和荧光素酶基因(pGL3)带入Hela细胞,最佳转染效率为P-PEILipo2000P-PEI-FA。低浓度血清存在时对转染效率影响不大,高浓度血清明显降低转染效率。P-PEI-FA对HeLa细胞的转染结果表明转染效率随FA浓度的增加而逐渐下降,而对Hep G2细胞的转染效率却不受FA浓度的影响,这说明P-PEI-FA可实现外源基因对特定肿瘤组织的靶向递送,有效提高外源基因的疗效。 3.载体/siRNA复合物的性能研究 凝胶阻滞实验表明P-PEI和P-PEI-FA在体外同样可以通过静电相互作用稳定结合siRNA。 RNAi实验显示P-PEI/siRNA和P-PEI-FA/siRNA均可有效抑制绿色荧光蛋白(EGFP)和荧光素酶(Luciferase)的表达,不同N/P差异不明显。内摄实验表明P-PEI/siRNA和P-PEI-FA/siRNA可通过内吞方式被细胞有效内摄。激光共聚焦结果显示,8h时P-PEI/FAM-siRNA和P-PEI-FA/FAM-siRNA复合物位于内涵体,24h时载体/siRNA复合物已成功实现内涵体逃逸,均匀分布在细胞质中。HeLa细胞中P-PEI-FA/siRNA抑制EGFP和Luciferase的表达与培养基中FA浓度成反比,Hep G2细胞内P-PEI-FA/siRNA对EGFP和Luciferase表达的抑制作用不受培养基中FA浓度的影响。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ460.1

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