NSCs三维培养及其微流控动态模型的构建

【摘要】：神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)是一类能够自我更新,并具有多向分化潜能的细胞。它的发现为深入研究神经系统的发育、神经退行性疾病治疗以及受损神经组织的临床移植带来新的希望。而要实现NSCs的各种潜能则必须对其各种生理生化特性有正确的认识与了解。因此,体外构建与体内微环境相似的NSCs模型是深入研究NSCs各种生理机制的重要方法与手段,已成为神经科学与神经组织工程研究领域的热点。 传统的NSCs体外细胞模型主要采用的是二维单层贴壁培养法和“神经球”悬浮培养法,细胞无法真正体现其在体内的生物学特性与功能。而以生物支架为基础的细胞三维培养则被认为更加接近哺乳动物体内真实微环境,已经成为体外研究NSCs增殖与分化机制、药物及环境毒素筛选与评价以及构建神经组织替代物的首选模型。目前,体外构建NSCs三维类神经组织的研究,在国内外还处于实验探索阶段,没有标准化的实验方法。因此,本文主要在NSCs体外三维培养方式及其生长与分化调控方面,开展了以下工作： (1)获取原代小鼠NSCs(mNSCs)并对其加以鉴定。通过原代培养方法从孕龄14d的昆明种小鼠胎脑的海马组织中获得mNSCs,考察了5个不同的接种密度对mNSCs生长趋势、所形成的“神经球”大小的分布以及扩增倍数的影响。最终确定了原代mNSCs的最佳接种密度为1×105cells/mL。传代培养的mNSCs能够稳定表达NSCs特征蛋白(Nestin和Sox2),经10%胎牛血清诱导能够分化成神经元(β-tubulin-Ⅲ阳性)、星形胶质细胞(GFAP阳性)以及少突胶质细胞(O1阳性),表明本实验分离获得的mNSCs具有自我更新与多向分化潜能。 (2)筛选并确定一种促进nNSCs体外扩增的无血清培养基MA。三维模型需要足够的细胞数量,因此本研究采用正交试验筛选并确定了能够提高mNSCs扩增倍数的培养基添加组分及其浓度与比例,MA显著地促进了mNSCs的增殖,细胞在对数增长期的最大密度可达到(7.25±0.23)×105cells/mL (p0.01),是初始接种密度((1.0±0.1)×105cells/mL)的7.25倍。同时,免疫荧光染色显示,MA培养的mNSCs其Nestin的阳性表达率为94.2±3.5%,说明优化后的培养基能很好地维持mNSCs的干细胞特性。同时,实验结果显示,MA中葡萄糖/谷氨酰胺配比对mNSCs生长有良好的促进作用,进一步确定了MA是一种适用于mNSCs体外扩增的新型优良培养基。 (3)提出一种基于两步培养的体外构建mNSCs三维静态模型的实验方法。该方法以0.5mg/mL的Ⅰ型胶原水凝胶为支架材料,采用两步培养法模拟体内神经发生的不同阶段的生理微环境。培养初期采用添加了EGF/bFGF/BSA/Lipids的DMEM/F12/RPMI-1640的促mNSCs增殖的培养基MA,待细胞形成直径至50-100μm左右的团簇时,将培养基MA更换为含有bFGF和BDNF生长因子的NB/B27条件培养基(MC)。团簇中的细胞开始沿着支架迁移,直到彼此相连形成神经组织样结构。此构建物内细胞生长状态良好且分布均匀,活率在82%左右,14.17±2.62%细胞仍保持mNSCs特性,而神经元比率为40.93±1.85%,星形胶质细胞比率为27.13±1.63%。 (4)建立了一种基于微流控技术的NSCs三维动态培养方法。mNSCs三维培养技术与微流控技术相结合,设计并建立了一套适合nNSCs三维生长的微柱阵列式微流体芯片培养系统。实现了以胶原水凝胶为支架材料的mNSCs三维复合物在微流体芯片上的构建与生长。结果显示,利用静态培养条件下建立的两步法在芯片上构建的mNSCs三维复合物中有NSCs特征蛋白Nestin的表达,同时具备分化成神经元和星形胶质细胞的能力；对一个培养周期内的细胞代谢产物进行取样分析,芯片三维培养体系中乳酸的浓度始终稳定在1.0mmol/mL以内,谷氨酰胺浓度维持在2.0mmol/mL左右,为mNSCs的生长提供一个稳定的生长环境；而三维静态培养条件下乳酸浓度随着半量换液在2.5～4.5mmol/mL间波动,谷氨酰胺浓度也会随着培养时间不断消耗需要人工补加。这种两步法构建芯片式mNSCs三维模型,操作简便,重复性好,成功率高。便于倒置显微镜下观测,有望成为新型药物筛选或环境毒素监测的神经组织替代物。

【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q813