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固态培养法增加微生物次级代谢产物的多样性

杨宁  
【摘要】:微生物具有迥异于其他生物的特殊生理结构与生存环境,能够产生结构新颖活性多样的次级代谢产物,一直以来都是新骨架化合物及药物先导化合物的重要来源。深度挖掘微生物资源产生新型次级代谢产物的潜力对于发现新骨架化合物和药物先导化合物具有重要意义。然而,微生物资源经多年开发利用,从中发现新药物或其先导结构越来越困难。本文通过比较34株土壤放线菌和45株海洋真菌在固态和液态培养基中次级代谢产物多样性的差别,探索了利用固态培养增加微生物次级代谢产物多样性的方法。 首先,以手霉素A及其衍生物的产生菌版纳链霉菌DL1026为实验对象,考察了其在固液两种培养方式下次级代谢产物多样性的差异,并对固态发酵条件和提取方法进行了优化,重点考察了培养基质的种类,发酵时间以及最适初始含水率对代谢产物多样性的影响,确立了固态发酵的最适条件:最佳固态培养基为麸皮培养基,最适发酵时间为11d,最适初始含水率为80%;最佳提取条件为发酵培养液70%乙醇(终体积浓度)超声浸泡提取,抽滤取滤液旋转浓缩蒸干,3mL甲醇溶解,过Sep-pak固相萃取柱,先用20%乙醇洗脱,所得洗脱液弃去;后用80%乙醇洗脱,所得溶液进行HPLC检测。 其次,在优化条件下对比了34株土壤放线菌和45株海洋真菌在固态和液态培养条件下次级代谢产物的差异。结果显示,13株放线菌在液态发酵条件下未产生次级代谢产物,占测试菌种的38.2%;而在麸皮培养基中不能进行生长且未产生次级代谢产物只有2株,占5.9%,且其中一株DL1029在液体培养基中也未发现次级代谢产物产生;85.3%的菌株(29株)的次级代谢产物在固态培养中多于液体培养,8.8%的菌株(3株)持平;34株土壤放线菌固态发酵共产生的次级代谢产物有效峰数量是液体发酵的3.5倍,扣除背景值和不同菌株中重复产生的次级代谢产物共产生34种次级代谢产物,是液态发酵的2倍。在固液两种不同的培养条件下,9株海洋真菌在液态发酵条件下未产生次级代谢产物,占测试菌种的20%,而在麸皮培养基中不能进行生长且未产生次级代谢产物只有4株,占8.9%,且其中DL22,DL36在液体培养基中也未发现次级代谢产物产生。46.7%的菌株(21株)的次级代谢产物在固态培养中多于液体培养,13.3%的菌株(6株)持平;45株海洋真菌固态发酵共产生的次级代谢产物的有效峰数比液体发酵提高了24%,扣除背景值和不同菌株中重复产生的次级代谢产物共产生40种次级代谢产物,比液态发酵提高了48.1%。 再次,对固态培养中次级代谢产物有效峰数明显高于液态培养的4株土壤放线菌和12株海洋真菌,进行了多次复筛,确立了DL45为“天才菌株”候选菌株,对其进行了菌种鉴定,并开展了其次级代谢产物的化学筛选和分离纯化,最终得到3个组分。 本研究表明固态培养法可以显著提高放线菌和真菌次级代谢产物的多样性,固态培养能够充分发掘现有微生物资源产生新次级代谢产物的潜能,加快微生物源新药研发进程。


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