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携带定点固载标签的人PTH表达纯化及其纳米抗体的淘选

王玉凤  
【摘要】:人体内过多的甲状旁腺激素(PTH)会造成继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)从而引发多系统病变,加重肾衰患者病情。目前,临床上降低PTH的方法有药物、手术、血液净化三种治疗方式。前两者副作用很大,间接加重肾脏的负担,而目前存在的血液净化方法对PTH的去除能力差,费用高,因此开发特异性的高亲和性吸附材料十分必要。纳米抗体具有独特的优势,是配基材料的最佳选择。目前利用噬菌体展示库筛选抗体的方法比较成熟,但是传统方法中利用疏水作用固载抗原筛选抗体会使蛋白二维结构发生变化,因此并不适用于亲水性的小分子蛋白类抗原。本研究将定点固载技术引入抗体筛选过程,可以保持抗原的天然构象。本论文尝试了两种用于定点固载的标签,经过比较,采用后者成功筛选出了抗人PTH的纳米抗体。研究内容如下: (1)带醛基的PTH的制备。利用合成的方法获得了甲酰甘氨酸生成酶(FGE)及带醛基标签前体的PTH的基因,并构建了一系列载体,尝试了体外催化和体内共表达催化两种醛基生成的策略,最后利用不相容质粒的共表达体系得到了带有醛基标签的目的蛋白,但带醛基的蛋白产量低,尚需深入研究。 (2)带巯基的PTH的制备。利用PCR技术在PTH的碳末端外加一个半胱氨酸,构建载体pET23a-PTH-C,在肠杆菌中实现了可溶表达,表达量在25%-30%之间,经过粗分离和阳离子交换层析,得到了纯度95%以上的终产品,利用Ellman试剂定性检测,证实了存在自由巯基。 (3)定点固载抗原法筛选纳米抗体。依据研究结果,利用巯基标签固载抗原,从非免疫纳米抗体库中筛选纳米抗体。比较了传统包被抗原法和定点包被抗原法,分别得到3种和13种纳米抗体序列,而且前面3种全部包含在后面13种中,说明定点固载更有利于特异性抗体的富集。同时比较了定点包被时pH为8.0和7.0的情况,分别得到了4种和13种纳米抗体,前者有3种包含于后者中,因此最佳固载pH为7.0。通过两组比较,最终获得了14种不同的纳米抗体,经噬菌体ELISA检测,有11种具有良好的结合活性。


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