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《大连理工大学》 2015年
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微生物处理海带饲料对刺参生长和免疫的影响

王熙涛  
【摘要】:刺参是我国单品种产值和利润最高的水产养殖动物,具有极高的营养价值和经济价值。近年来随着市场需求的增长和天然资源的减少,刺参的人工养殖规模迅速扩大。随着刺参养殖的高密度集约化发展,占整个养殖成本50%以上的饲料问题成为制约刺参养殖业健康发展的瓶颈。其中优质饵料匮乏、饲料利用率低及残饵败坏水质等问题是最至关重要的因素。本课题以产量高、成本低的海带饲料原料为切入点,利用筛选出的有益微生物对海带原料中大量褐藻胶成分进行发酵降解,研究开发一种可供选择的具有原料增值功能的刺参微生物脱胶海带饲料。该饲料中难以被刺参消化吸收的褐藻胶成分可以被微生物有效降解,从而显著提高刺参对海带饲料原料的利用率,促进其生长性能的提升,而且降解产物褐藻胶寡糖本身又是一种免疫促进剂,使原本不能被充分消化吸收的大量海带褐藻胶成为潜在的天然绿色刺参免疫增强剂。同时,有效发挥饲料中高活性有益微生物的益生作用,增强刺参肠道消化酶活性,更好地满足刺参对营养物质的吸收利用,并能抑制潜在条件致病菌的生长,促进刺参非特异免疫应答,增强刺参对致病弧菌的抵御能力。论文主要工作如下:(1)利用褐藻酸钠为唯一碳源的选择性培养基,从海泥中筛选得到一株具有较高褐藻胶降解能力的菌株。16S rDNA测序及生理生化试验表明WB1属于水产常用菌属—Bacillus属,系统发育树分析表明其与Bacillus amyloliquifaciens有最高的同源性;高浓度腹腔攻毒试验表明B. amyloliquifaciens WB1对刺参无潜在致病性;体外抑菌试验表明B. amyloliquifaciens WB1对三种常见的刺参致病弧菌(Vibrio splendidus、Vibrio tasmaniensis、Vibrio cyclitrophicus)具有一定的抑制效果;利用薄层层析及分子排阻色谱对B. amyloliquifaciens WB1褐藻胶裂解酶酶解褐藻胶的终产物进行分析,发现其主要为二糖和三糖,相对含量分别为74.1%和25.9%;高效凝胶渗透色谱测定酶解终产物褐藻寡糖的平均分子量为516 Da。(2)对菌株WB1降解海带中褐藻胶的发酵条件进行了优化,选取8个半固体发酵中可能影响褐藻胶降解量的因素,即发酵时间,NaCl浓度,补充氮源,补充碳源,发酵初始pH,液料比,接种量,发酵温度。利用单因素试验确定各因素的最大响应区域,在最大响应区域基础上,通过Plackett-Burman试验筛选出影响褐藻胶降解量的主要因素为:液料比,补充氮源牛肉膏提取物含量及发酵时间。在PB试验基础上利用Central Composite Design试验设计及响应面方法进行回归分析,求解回归方程得到进一步优化的褐藻胶降解条件:发酵时间为113.94 h,液料比为44.87 L/g,牛肉膏含量0.3%,结果显示实际褐藻胶平均降解量为56.88%,比条件优化之前最多提高45.17%。(3)通过体外实验研究了3种不同分子量范围的褐藻寡糖(AOS)及其相应两种类型的糖醛酸片段(M段和G段)对刺参体腔细胞非特异免疫应答的促进效果。利用改进后的L-15细胞培养液对刺参体腔细胞进行体外培养,对刺参体腔细胞分别给予不同分子量范围及组成成分的AOS刺激。结果表明,刺参体腔细胞的吞噬率和超氧阴离子产生量,以及部分非特异免疫相关酶的活性(溶菌酶,过氧化物酶,一氧化氮合酶)都有一定程度增强,且增强程度与AOS分子量具有一定相关性。AOS相应的纯甘露糖醛酸低聚物片段(M)和古罗糖醛酸低聚物片段(G)片段都对上述非特异免疫指标具有促进作用,且除了A1(M)组和A1(G)组对吞噬率的促进有显著性差异外,其他各组的M和G之间对非特异免疫指标的促进效果均没有显著性差异。(4)通过养殖实验考察微生物发酵脱胶海带饲料对刺参生长性能及非特异免疫应答的实际促进效果。结果表明,与未处理的海带饲料原料相比,通过饲喂本实验刺参含有活B. amyloliquefaciens WB1的微生物发酵脱胶海带饲料,可以显著提高其生长性能,而与饲喂含有优质饵料鼠尾藻的商品饲料相比并无显著性差异;通过饲喂刺参含有活B. amyloliquefaciens WB1的微生物发酵脱胶海带饲料,可以促进本实验刺参体腔液中多种非特异免疫相关酶的活性,并提高刺参抵御病原灿烂弧菌感染的能力;与其他试验组相比,通过饲喂刺参含有活B. amyloliquefaciens WB1的微生物发酵脱胶海带饲料,可以显著增加本实验刺参肠道中具有降解褐藻胶能力的细菌数量,并能显著降低潜在条件致病弧菌的数量。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S968.9

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