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《大连理工大学》 2017年
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利用可溶性诱导物批式流加发酵培养里氏木霉生产纤维素酶

李勇昊  
【摘要】:基于木质纤维素类生物质资源生产的生物燃料和生物基化学品具有可再生和环境友好的优点,对经济和社会可持续发展具有重要意义。这类生物质的生物炼制主要包括预处理、纤维素酶生产、纤维素组分酶解糖化和微生物发酵等单元操作及这些操作单元的系统集成和优化,而纤维素酶成本高是制约生物炼制产业化技术开发的瓶颈之一。里氏木霉(Trichoderma reesei)是纤维素酶高产菌株,但该菌株纤维素酶合成需要诱导。纤维素是T.reesei纤维素酶合成的天然诱导物,以微晶纤维素最有效,尽管其价格昂贵。然而,纤维素是不溶性的,需要依靠菌株低水平本底纤维素酶缓慢水解释放出真正诱导物才能诱导纤维素酶大量合成,这一过程显著延长了纤维素酶发酵时间,相应降低了发酵罐纤维素酶生产强度。由于T.reesei液体深层发酵生产纤维素酶为高粘度非牛顿型流体且强好氧过程,生产强度低导致纤维素酶发酵过程搅拌和通风的能耗成本极高。使用预处理后的秸秆、蔗渣及纸浆等廉价纤维质原料作为诱导物,虽然可以解决微晶纤维素等成本高的问题,但菌株本底纤维素酶水解这类纤维质原料的效率极低,导致诱导产纤维素酶效果非常差,纤维素酶发酵生产的能耗成本更高。可溶性诱导物可以被菌株直接利用,预期可以有效解决纤维素类诱导物存在的突出问题,然而目前开发的乳糖等可溶诱导物不仅成本较高,而且纤维素酶诱导效果差。本研究合成了低成本高效可溶诱导物,在此基础上以T.reeseiRut C30为模式菌株,对纤维素酶的发酵生产、纤维素酶系改造优化以及原位生产的粗酶水解预处理后秸秆等过程进行了研究。以葡萄糖为底物,利用β-葡萄糖苷酶催化的转糖苷反应,制备含(β)二糖的可溶诱导物。转糖苷反应特点使反应结束时残留大量葡萄糖,这种葡萄糖和(β)二糖混合物(MGD),可以更好促进菌丝生长,同时高效诱导纤维素酶合成。此外,还选择并研究了 β-1,3-葡聚糖对T.reesei生长和纤维素酶合成的诱导效果。摇瓶实验结果表明MGD和β-1,3-葡聚糖更容易被菌体利用,诱导纤维素酶合成能力分别是乳糖的1.16倍和1.24倍,纤维素酶关键组分基因表达分析进一步验证了这些实验结果。虽然MGD和β-1,3-葡聚糖诱导里氏木酶产纤维素酶效果相近,但是MGD成本较低。利用离子色谱分析了MGD的组成,发现二糖类诱导物主要为龙胆二糖、纤维二糖和槐糖,其中槐糖起最主要诱导作用。比较了酸水解甜菊糖苷制备槐糖和β-葡萄糖苷酶催化转化葡萄糖制备MGD,与酸水解甜菊糖苷相比,β-葡萄糖苷酶催化转化葡萄糖制备MGD在成本以及过程重复性上都有优势,而且无论是使用商业β-葡萄糖苷酶还是自制β-葡萄糖苷酶,其催化转化高浓度葡萄糖生成的MGD,均能高效诱导里氏木霉生产纤维素酶。以MGD为诱导物,在7 L发酵罐中进行液体深层培养T.reesT.Rut C30生产纤维素酶。为避免MGD中高浓度葡萄糖对里氏木霉合成纤维素酶的抑制,开发了基于控制发酵液中葡萄糖浓度流加MGD进行补料的策略,葡萄糖浓度控制为0.05-0.30 g/L。实验结果表明,发酵时间144 h时,纤维素酶活达到90.4 FPU/mL,比报道的乳糖诱导纤维素酶酶活水平高10倍以上,纤维素酶生产强度高达627.1 FPU/L/h,是目前报道T.reesei生产纤维素酶生产强度的3-5倍。为了评价MGD诱导的纤维素酶(Cel-MGD),测定两种纤维素酶的比酶活并利用分泌蛋白组学分析对比了 Cel-MGD与碱预处理后玉米秸秆(APCS)作为诱导物生产纤维素酶(Cel-APCS)的蛋白组成,结果表明Cel-MGD诱导的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶比酶活分别提高1.74倍和2.42倍,但Cel-MGD中仍严重缺乏β-葡萄糖苷酶,而Cel-APCS含有更高的木聚糖酶活和纤维素降解辅助蛋白。为了弥补Cel-MGD中严重缺乏β-葡萄糖苷酶的缺陷,构建了组成型强启动子Ppdcl高效过表达外源β-葡萄糖苷酶基因aabgll的表达载体,并利用农杆菌介导的遗传转化方法将其导入T..reeseiRutC30,转化子生产β-葡萄糖苷酶的能力普遍提高。利用产葡萄糖苷酶最高的重组菌T.reesei PB3分批补料发酵生产纤维素酶,156 h纤维酶活超过50 FPU/mL,β-葡萄糖苷酶酶活超过310 CBU/mL,比宿主菌β-葡萄糖苷酶酶活提高约70倍。该重组酶命名为Cel-MGD2,其与补加商品β-葡萄糖苷酶的Cel-MGD水解15%(w/v)APCS性能无显著差别,葡萄糖收率均超过92%,发酵过程乙醇浓度超过44.0 g/L。提高APCS的浓度到20%(w/v),利用Cel-MGD2进行分步糖化发酵(SHF)和同步糖化发酵(SSF)生产乙醇,在SHF工艺条件下发酵120h,终点乙醇浓度达到54.2 g/L,而SSF条件下发酵96h,终点乙醇浓度为52.1g/L。虽然SSF过程产乙醇浓度略低,但乙醇生产强度显著提高。这些结果表明改造后的重组酶不需要复配就可以用于预处理后秸秆类生物质水解。为实现纤维素和半纤维素的综合利用,在T.reesei Rut C30过表达同源外切纤维素酶基因cbh2构建纤维素酶高产菌株,并以MGD和APCS混合诱导物提高纤维素酶中木聚糖酶活性,生产可高效水解含有高浓度半纤维素原料的纤维素降解酶。优化MGD和APCS比例后,通过分批补料,发酵60h时纤维素酶活达到7.17FPU/mL,木聚糖酶活性达到577.55 IU/mL,该粗酶液比MGD或APCS单独诱导的纤维素酶降解APCS的效果更好,而且粗酶液不需要进行任何处理即直接进行预处理后的秸秆水解,粗酶液提高温度至50℃,批次加入APCS至20%,最终测定释放122.5 g/L葡萄糖和40.21 g/L木糖,产糖效果高于已有报道。研究工作进展对高效生产纤维素酶,特别是原位产酶应用于木质纤维素类生物质生物炼制,具有重要意义。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ925

【参考文献】
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