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《大连理工大学》 2017年
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溶藻弧菌噬菌体特性及其防控刺参感染的研究

张建城  
【摘要】:刺参(Apostichopus japonicus)是我国北方沿海地区最具规模的经济类海水养殖动物,具有极高的药用价值和商业价值。近年来,随着刺参养殖规模的快速发展,由弧菌为主要病原菌引发的腐皮综合征给刺参养殖业造成严重的经济损失。据统计,仅2003~2005年,由该病导致的经济损失就高达20亿元,其患病幼参的死亡率高达90%以上,该病已成为制约刺参养殖业发展的一大难题。研究证明,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为引起该病的主要病原菌之一。噬菌体疗法是一种利用噬菌体对目标宿主菌的裂解作用,主动降低病原菌密度,进而减少或者避免病原菌感染或发病的生物防控技术。现有研究表明,水体养殖是噬菌体应用的理想环境,水体介质的高流动性可提高噬菌体的扩散能力,且噬菌体自身具有安全无毒害、高效低成本和研发周期短的特点,极其适宜作为一种抗生素替代品应用于水产养殖的病原防控。本研究以刺参致病性溶藻弧菌为宿主,筛选其裂解性噬菌体并考察噬菌体在水产养殖环境中对溶藻弧菌的防控效果。研究主要工作如下:(1)从患有腐皮症的病参病灶处分离获得非溶源性溶藻弧菌一株,经验证对健康刺参具有单一菌株致病性(半数致死量分别为腹腔注射攻毒9.44 ×103CFU/g,浸浴攻毒1.82 × l06 CFU/mL),该菌对氨苄西林和链霉素具有耐药性;分离获得两株溶藻弧菌裂解性噬菌体PVA1和PVA2,经形态学观察两株噬菌体都为有尾目噬菌体,PVA1为短尾科噬菌体而PVA2为肌尾科噬菌体;噬菌体PVA1潜伏期为20 min,裂解量为108 PFU/cell,噬菌体PVA2的潜伏期约30 min,裂解量为98PFU/cell;两株噬菌体均可在12 h内抑制溶藻弧菌的生长,且最适pH值在6.0~8.0之间;(2)全基因组测序结果显示噬菌体PVA1基因组为双链线性DNA,全长41529 bp,GC含量为43.7%并且无编码tRNA基因的存在;预测出75个开放阅读框,占全基因组93.32%;预测出推定功能基因21个,可将噬菌体基因组分为结构基因、DNA包装、DNA复制和调控及其他功能基因共四部分;未发现与噬菌体PVA1基因组具有同源性的其他噬菌体;(3)对噬菌体PVA1中内溶素推定基因gp60进行生物信息学分析,结果显示,预测蛋白大小为171 aa,分子量19.41 kDa,并在6~94位存在一个糖基水解酶的活性域,在58~159位存在一个肽聚糖结合域,为典型的革兰氏阳性菌噬菌体内溶素的功能域结构布局;将gp60内溶素基因进行克隆并原核表达,结果显示重组内溶素为部分可溶性表达,分子量小于20 kDa;使用浊度法检测重组内溶素对经EDTA处理后的溶藻弧菌的裂解酶活,测算其酶活为1184± 163 U/mg,显著低于商品化蛋清溶菌酶;(4)利用噬菌体PVA1、PVA2及二者的混合噬菌体制剂对经溶藻弧菌浸浴攻毒的刺参进行预防试验。结果显示,施用1.0×107 PFU/mL的混合噬菌体对刺参保护效果最佳且与5 mg/L强力霉素试验组无显著性差异;不同噬菌体与抗生素对经溶藻弧菌腹腔注射攻毒的刺参治疗试验结果显示,刺参在经腹腔注射攻毒后噬菌体施用的时间点越早治疗效果越好,但各噬菌体组的刺参存活率显著低于强力霉素试验组;相比于注射溶藻弧菌,向健康刺参腹腔液中注射溶藻弧菌与噬菌体的混合物可显著减弱溶菌酶、酸性磷酸酶和过氧化物酶的活性,增强一氧化氮合酶的活性;(5)将噬菌体冻干粉添加至刺参基础饲料饲喂养殖刺参,经60天试验结果表明,与未添加噬菌体的饲料相比,添加噬菌体PVA1、噬菌体PVA2和二者的混合噬菌体不会显著提升刺参的生长性能,但可以促进刺参体腔液中多种非特异性免疫相关酶的活性;饲喂添加噬菌体的饲料不会对肠道中弧菌数量造成显著性影响,但可显著提高刺参抵御溶藻弧菌感染的能力。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S947.9

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