收藏本站
《大连理工大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗β_2微球蛋白纳米抗体83F的E.coli制备

任学敏  
【摘要】:β_2微球蛋白(β_2-microglobulin,β_2M)在慢性肾衰竭患者体内不能被正常代谢,过量的β_2M积累会导致淀粉样变,目前血液透析无法去除过量的β_2M。纳米抗体体积小、亲和力高、免疫性强、易于融合表达,在免疫吸附治疗方面有重要的价值。因此,制备大量的抗β_2M纳米抗体具有重要的临床意义,E.coli由于其低廉的培养成本和简单的操作过程,被认为是首选的制备纳米抗体的策略。抗β_2M纳米抗体83F对β_2M亲和力较高,结合特异性较强,但初步研究发现,其主要以包涵体形式存在。为了获得更多有活性的83F,本论文从不同宿主、不同融合标签表达及优化包涵体复性条件等多方面进行了研究。具体研究内容如下:(1)抗β_2M纳米抗体83F的载体构建及表达:通过基因重组技术,将抗β_2M的纳米抗体83F基因序列克隆入pET29a、pET32a、pET39b、pET40b、pET41a及pET28a、,成功构建了6种重组质粒并转化至E.coli Shuffle T7(DE3)、E.coli Origami~(TM)2(DE3)、E.coli BL21(DE3)中,均获得稳定表达。通过对表达条件进行优化,发现83F在E.coli Shuffle T7(DE3)和E.coli BL21(DE3)内的表达量要明显优于E.coli Origami~(TM)2(DE3);添加融合标签可以提高83F的表达量;37℃诱导表达量高于18℃诱导。(2)抗β_2M纳米抗体83F的可溶性分析:纳米抗体在18℃的低温条件下诱导表达,得到的可溶蛋白较多,其中以E.coli Shuffle T7(DE3)为宿主,以pET39b和pET40b为载体的可溶表达量最高,分别占上清表达量的14%、16%,每升TB培养基可得到纯度分别为93%和95%纳米抗体62 mg和77 mg;通过ELISA和SPR定性、定量测定纳米抗体亲和活性,结果表明融合表达的纳米抗体S39和S40均与抗原有较高的结合活性,平衡解离常数分别为1.1318×10~(-6)M和3.457×10~(-7)M;以pET40b为载体表达纯化后的纳米抗体切除融合标签后,SPR检测表明,其平衡解离常数为2.529×10~(-7)M,切除标签前后,纳米抗体亲和力接近。(3)抗β_2M纳米抗体83F的包涵体复性:37℃诱导温度下,以E.coli BL21(DE3)为宿主,以pET29a为载体的包涵体表达量最高,占沉淀表达量的62%。对包涵体进行稀释复性,优化得到最适宜的复性条件为:初始蛋白浓度0.4 mg/ml、20 mM Tris-HCl(pH8.0)复性缓冲液含有200 mM精氨酸、还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比例为1:2和12.5 mM 2,6-二甲基-β-环糊精,滴加速度3 ml/min,在4℃条件下静置16 h;最终可从1 L TB培养基中获得复性后纳米抗体83F 1221 mg,纯度可达95%。圆二色光谱检测证明添加合适添加剂后,有利于纳米抗体二级结构的正确形成,在4℃条件下静置16h后,复性蛋白与上清中蛋白的二级结构以及平衡解离常数相似,说明复性后蛋白与抗原有较高的结合活性,并且具有正确的二级构象。总之,本文以E.coli为宿主,成功制备了抗β_2M纳米抗体83F,一方面对原始纳米抗体通过添加融合标签,提高了纳米抗体的总表达量及可溶表达量;另一方面通过对包涵体稀释复性条件的优化,成功复性了包涵体,但比较分析发现包涵体复性的方法制备纳米抗体83F的成本较低。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前17条
1 王龙刚;邬敏辰;王武;;胆固醇氧化酶基因的克隆及在E.coli中的表达[J];微生物学通报;2006年06期
2 杨志兴,Lender Force;美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达[J];生物技术;1991年04期
3 杨志兴,Lender Force;美洲拟鲽抗冻蛋白基因在E.coli中表达的研究[J];遗传;1992年01期
4 马江锋;梁丽亚;刘嵘明;张敏;陈可泉;姜岷;韦萍;;基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响[J];南京工业大学学报(自然科学版);2011年03期
5 钟学敏;张玲;孙艳;杨海麟;王武;;重组E.coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究[J];生物技术通报;2009年05期
6 唐雪明,邵蔚蓝,沈微,王正祥,方惠英,诸葛健;Bacillus licheniformis 6816碱性蛋白酶基因在E.coli中的克隆和表达[J];生物技术;2001年04期
7 王健,沈卫英,周清平,申庆祥;人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基端37肽四聚体基因在E.Coli中的表达[J];生殖与避孕;2000年03期
8 贾云鹏;程宁;;三黄汤对E.coli内ESBLs基因表达的干预性研究[J];西部中医药;2012年08期
9 陈茹;王行国;何婷;张萍萍;;E.coli酪氨酸转氨酶的纯化与非天然氨基酸的底物特异性检测[J];湖北大学学报(自然科学版);2010年02期
10 衣美英,刘桂荣,朱永红,朱万孚,刘树林;E.coli临床分离株的基因组结构分型[J];中华微生物学和免疫学杂志;2003年12期
11 苏帅;段作营;李华钟;;Gluconobacter oxydans WD膜结合山梨醇脱氢酶基因在E.coli中的克隆表达[J];工业微生物;2014年03期
12 张召兴;张香斋;李蕴玉;张艳英;常超越;贾青辉;李佩国;;鸡致病性E.coli地方株血清型的鉴定、毒力基因及致病性检测[J];中国兽医学报;2017年12期
13 常冰梅,牛勃,程牛亮,张悦红,王惠珍,解军;人肝细胞生长因子β链在E.coli中的表达、纯化及活性测定[J];中国生物制品学杂志;2003年04期
14 陈作雁;张璟;董坤;安兴才;胡晓宁;;窖水中主要无机离子对光催化灭除大肠杆菌(E.coli)的影响研究[J];甘肃科学学报;2017年05期
15 杨丹燕;林陈水;;提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性[J];浙江工业大学学报;2009年04期
16 严明,许伟,陈菲;E.coli天冬氨酸转氨酶结构与功能关系的研究进展[J];生物加工过程;2004年03期
17 沈仓良;姚文;陈伟华;朱伟云;邹思湘;;伴大豆球蛋白水解肽对灌喂大肠杆菌(E.coli)的小鼠肠道微生物区系和健康的影响[J];中国现代医学杂志;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 乔军;孟庆玲;才学鹏;景志忠;张艳;田广孚;郭爱疆;;中国白兔白介素-15基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年
2 乔军;夏咸柱;杨松涛;胡桂学;谢之景;闰芳;黄耕;;犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年
3 刘维明;沈东;黄和;胡燚;;共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶重组E.coli催化合成L-叔亮氨酸[A];中国化学会第29届学术年会摘要集——第28分会:绿色化学[C];2014年
4 韩冬梅;仲飞;李秀锦;王微;王幸兴;潘素敏;;E.coli不耐热肠毒素B亚基增强犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫应答的研究[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
5 郗鑫;陈焕春;李川;曹胜波;琚春梅;;猪2型圆环病毒ORF1基因克隆及在E.coli中的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
6 杨松涛;夏咸柱;乔军;高玉伟;阎芳;谢之景;赵忠鹏;黄耕;;SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达与初步应用[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
7 刘珍;黄瑞;;伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力和E.coli体内生物膜形成的影响[A];中华医学会2014全国微生物学与免疫学学术年会论文汇编[C];2014年
8 乔军;孟庆玲;才学鹏;景志忠;张艳;田广孚;郭爱疆;;中国白兔白介素-15基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的表达[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 郑杨春;邓旭;李清彪;卢英华;何宁;孙道华;彭雅娟;;高选择性基因工程菌E.coli在含汞环境中的生长富集耦合[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
10 丁邵珍;廖小平;涂伟忠;吴玲;胡黔楠;;EcoSynther—E.coli生物合成潜力挖掘能手[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第二十八分会:化学生物学[C];2016年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 毛华;重组人干细胞因子(rhSCF)在E.coli中的高效表达及其与重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)融合基因克隆、表达、蛋白纯化及性质的研究[D];中国协和医科大学;1998年
2 张晗星;聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究[D];山东大学;2006年
3 方晶晶;河北平原邯郸地区地下水硝酸盐污染来源及迁移转化过程的多元素同位素及微生物(E.coli)示踪[D];中国地质大学;2014年
4 周丽;高产高纯D-乳酸的E.coli代谢工程菌的构建[D];江南大学;2012年
5 于学辉;鸭致病性E.coli外膜蛋白及相关毒力基因和新血清型发现及病原特性研究[D];四川农业大学;2008年
6 白丁平;PiggyBac转座子介导的转E.coli半胱氨酸合成酶基因绒山羊研究[D];西北农林科技大学;2012年
7 陈晓龙;E.coli赖氨酰-tRNA合成酶(LysU):结构与功能研究[D];浙江大学;2011年
8 刘忠臣;不同来源脂肪对仔猪的营养效应及对E.coli攻毒的保护作用研究[D];四川农业大学;2011年
9 SHER BAHADAR KHAN;[D];华中农业大学;2016年
10 班兆军;浆果中天然抗菌成分对食源性致病菌的抑制机理研究[D];新疆农业大学;2015年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 任学敏;抗β_2微球蛋白纳米抗体83F的E.coli制备[D];大连理工大学;2018年
2 杨坤;E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建[D];西北农林科技大学;2010年
3 杨柳;中药丹参提取物对大肠杆菌(E.coli)环丙沙星耐药性的消除作用[D];西南大学;2006年
4 徐英贤;几种改性矿物和碳纳米管对E.coli的抑制和内毒素的吸附[D];华中农业大学;2006年
5 曲洁;苹果酸脱氢酶及异柠檬酸脱氢酶扩增对E.coli产琥珀酸的影响[D];天津大学;2009年
6 刘佳林;重组融合蛋白在E.coli中可溶性表达及抗原活性研究[D];吉林大学;2016年
7 宋照雷;E.coli中高效表达外源蛋白的探索及其在纳豆激酶中的应用[D];暨南大学;2002年
8 蒋月;Ⅰ型整合子与E.coli多重耐药性的相关性研究[D];东北农业大学;2006年
9 张瑶;β-葡萄糖苷酶分泌表达型乙醇发酵E.coli工程菌的构建[D];华东理工大学;2013年
10 王长城;提高重组E.coli产胆固醇氧化酶水平的研究[D];江南大学;2009年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978