收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

hTR基因在细胞中的表达及检测端粒酶活性方法的研究

金礼吉  
【摘要】: 端粒酶(telomerase)是由端粒酶RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)。端粒酶含有引物特异识别位点,能以自身RNA为模板,逆转录合成端粒DNA并加到染色体末端,使端粒延长,从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。端粒酶之所以能成为肿瘤治疗的新靶点,在于大多数正常组织中没有活性或活性极低,而在恶性肿瘤的发生、发展中起着关键的作用。本研究根据端粒酶的结构和功能以及端粒酶的反应特点,从以下几方面进行了研究。 1.利用基因工程技术从HeLa细胞中克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因。将hTR基因插入逆转录病毒载体pLNCX中,构建了hTR基因的反义重组质粒pLNCX-aTR和正义重组质粒pLNCX-TR,测序结果表明符合预期要求,为下一步实验奠定了基础。 2.反义重组质粒pLNCX-aTR转染人肝癌SMMC-7721细胞,结果发现pLNCX-aTR的表达有效地封闭或抑制肝癌细胞的端粒酶活性,使细胞的生长和增殖受到抑制,细胞体积变小、核致密、核荧光强度增强,且促进其凋亡。琼脂糖凝胶电泳基因组DNA可见到约以200bp为间隔的DNA梯状(ladder)条带。以上结果均符合细胞凋亡的形态学及生物化学特征。由此证明,反义hTR基因的表达可导致人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡,为下一步哺乳动物个体中的表达研究奠定基础。 3.将正义重组质粒pLNCX-TR,在体外导入人体正常外周血白细 hTR基因在细胞中的表达及检测端粒酶活性方法的研究 胞中表达,结果发现虽然hTR基因的RNA量增加了,但白细胞的端 粒酶活性并没有发生明显的改变,说明hTR基因的过表达不能增强白 细胞端粒酶活性。进一步用流式细胞术分析发现,hTR基因的过表达 不仅使白细胞的增殖受到抑制并促进其凋亡。分析其原因,可能是hTR 基因的过表达在数量和空间效应上同细胞内的端粒酶RNA 组分产生 竟争,一定程度上阻碍了端粒酶RNA模板区与端粒DNA的结合,从 而抑制端粒DNA的延伸,导致细胞凋亡。 4.在Kim等开发的端粒重复扩增分析法(TRAP)的基础上进行 改进,即通过对端粒酶延伸TS寡核昔酸反应产物的精制,消除了PCR 扩增中抑制Taq酶活性的因素,从而减少了样品之间PCR扩增上的 差异和假阴性现象的发生,提高了判断样品端粒酶阴、阳性的准确率 和定量的准确性。运用DNA测序法检测端粒酶活性结果表明,反应 的特异性强、灵敏度高,细胞数与端粒酶活性之间基本成线性关系。 TRAP与DNA测序相结合检测端粒酶活性的方法,操作简便、快速、 经济、无放射性危害,可在3—4小时内得到检测结果,大大缩短了检 测时间,为研究端粒酶活性的调节机制、端粒酶与恶性肿瘤之间的关 系以及临床上鉴别和诊断肿瘤的良恶性提供了一种检测手段。


知网文化
【相似文献】
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 庄然;张圆;邓虎平;金伯泉;;基于CFSE/PI双标记法检测细胞杀伤水平方法的建立[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
2 秦彩玲;刘婷;李东成;张毅;武桂兰;张淑运;李先端;李春;黄璐琦;;采用生物活性法制定中药材质量标准初探——半夏药材的质量标准研究[A];全国中药标准研究学术研讨会论文集[C];2005年
3 李旺;刘卓靓;林卉;聂舟;陈金华;徐霞红;姚守拙;;基于甲基化响应DNAzyme的无标比色法测定甲基转移酶活性[A];中国化学会第27届学术年会第03分会场摘要集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 金礼吉;hTR基因在细胞中的表达及检测端粒酶活性方法的研究[D];大连理工大学;2002年
2 王妍;重组人神经生长因子的克隆、表达、纯化、性质和其应用的研究[D];吉林大学;2006年
3 吕文天;酸性成纤维细胞生长因子核转位序列敲除对其有丝分裂活性的影响[D];吉林大学;2005年
4 路英丽;人腺激肽释放酶2的重组表达、活性测定及临床应用研究[D];吉林大学;2006年
5 曲亚明;锰型过氧化物酶与鼻咽癌放射敏感关系研究[D];中南大学;2010年
6 刘平;端粒酶在脑胶质瘤中的研究[D];第二军医大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李常伟;骨骼肌生物电阻抗与组织生物活性相关性的初步研究[D];河北医科大学;2012年
2 周勇;表达EPO-Fc融合蛋白的工程细胞株鉴定与融合蛋白性质及质控标准研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
3 李思颖;HPLC测定胆固醇代谢酶(CYP7A1)活性方法学的建立[D];山东大学;2010年
4 覃柳燕;广西眼镜蛇毒神经生长因子的实验研究[D];广西医科大学;2010年
5 王一秋;米糠功能组分的制备及研究[D];江南大学;2011年
6 张鹏;海洋蜡状芽孢杆菌041381菌株产抗真菌蛋白的分离纯化[D];华南热带农业大学;2005年
7 刘剑利;金属螯合亲和层析纯化玉米SOD及其修饰与固定化[D];沈阳农业大学;2005年
8 许理;鱼腥草素同系物对枯草杆菌抗菌机理研究[D];西南大学;2010年
9 姜传杰;体外测定生物材料诱导成骨活性方法的建立和应用[D];泰山医学院;2005年
10 张学维;塔里木马鹿茸基因鉴定及其冻干粉生物学活性研究[D];北京中医药大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 汤姆·欧文(Tom Irving) 王宁玲;从一件专利案看独立于可实施性要求的书面说明要求[N];中国知识产权报;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978