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人参皂苷糖基水解酶的研究

张春枝  
【摘要】: 本文以专一水解人参皂苷特定糖基为目的,进行了人参皂苷糖基水解酶的分离纯化、性质研究、以及人参皂苷Rg3和Rc的定向酶解反应,证明了酶法定向改造人参皂苷结构的可能性。 采用缓冲液抽提、硫铵沉淀、离子交换层析法从人参根中分离纯化了两种人参皂苷糖基水解酶——人参皂苷-β-葡萄糖苷酶和人参皂苷-α-阿拉伯糖苷酶。人参皂苷-β-葡萄糖苷酶被纯化了16倍,收率为14.4%,人参皂苷-α-阿拉伯糖苷酶被纯化了18.5倍,收率为4.6%。PAGE检测纯化后的酶为单一谱带。 人参皂苷-α-葡萄糖苷酶能水解人参皂苷Rg3生成人参皂苷Rh_2,最适作用温度为55-60℃,最适pH为5.0,Ca~(++)对该酶有激活作用,Cu~(++)有抑制作用。该酶在60℃以下,pH4.0-7.0稳定,SDS-PAGE测得分子量为59kDa。此酶N-端氨基酸序列为SLDANYVPKYVTLPL,与已知序列的β-葡萄糖苷酶无同源性,人参皂苷-β-葡萄糖苷酶在水解特性上也不同于传统的β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。本文还建立了人参皂苷-β-葡萄糖苷酶催化Rg3反应的米氏方程。 人参皂苷-α-阿拉伯糖苷酶能水解人参皂苷Rc生成人参皂苷Rd,最适作用温度为50℃,最适pH为5.0,Cu~(++)对酶有抑制作用。该酶在60℃以下,pH4.0-6.0稳定,SDS-PAGE测得分子量为86kDa。 人参皂苷糖基水解酶在底物浓度10mg/ml,pH5.0,55℃的条件下水解人参皂苷Rg3,反应24h,Rg3的转化率可达到60%。经饱和正丁醇萃取,硅胶柱分离,酶解产物Rh_2纯度可达90%,得率为32%。人参皂苷-β-葡萄糖苷酶能水解20(S)-Rg3和20(R)-Rg3分别生成20(S)-Rh_2和20(R)-Rh_2,水解速度大体相同。核磁共振(~1HNMR、~(13)CNMR)和质谱(MS)检测结果显示,酶解20(S)-Rg3所得产物为20(S)-Rh_2,系统名称为3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-达玛-24-烯-3β,12β,20(S)-三醇;酶解20(R)-Rg3所得产物为20(R)-Rh_2,系统名称为3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-达玛-24-烯-3β,12β,20(R)-三醇,分子式为C_(36)H_(62)O_8,分子量为622。 人参皂苷糖基水解酶在底物浓度30mg/ml,pH5.0,50℃的条件下水解人参皂苷Rc,反应24h,Rc的转化率可达到60%。经饱和正丁醇萃取,硅胶柱分离,酶解产物Rd纯度可达90%,得率为34%。核磁共振(~1HNMR、~(13)CNMR)和质谱(MS)检测结果表明,酶解产物为20(S)-人参皂苷Rd,系统名称为3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基)-20-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-达玛-24- 摘 要 烯与p,126,20o卜三醇,分子式为 C48H82Ol以 分子量为 946。 本文在证明酶法定向转化人参皂着制备稀有皂苦可行性的同时,为深入研究 糖着水解酶尤其是皂苦糖基水解酶奠定了一定的实验基础。


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