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《大连理工大学》 2002年
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辽宁碱蓬甜菜碱合成酶基因克隆及转基因烟草耐盐性研究

李秋莉  
【摘要】: 甜菜碱是生物体内普遍存在的一种很有效的渗透调节剂。高等植物中,甜菜碱由胆碱经两步酶催氧化得到,即:胆碱--→甜菜碱醛--→甜菜碱,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶(choline monooxygenase,CMO),催化第二步反应的酶是甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)。辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis Kitag)是一种耐盐性很强的盐生植物,本文对其甜菜碱、甜菜碱合成酶、甜菜碱合成酶基因进行了较为系统的研究。 用化学比色法测得辽宁碱蓬叶片中的甜菜碱含量为95.5μg/g.FW,低于盐吸,高于已测定的其它植物中的含量。 通过硫酸铵分级沉淀、离子交换和凝胶过滤层析相结合的方法,将辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶分离纯化为电泳纯,纯化倍数为206倍,比活达到2363nmol/min·mg。辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶分子量为129kD,单个亚基的分子量为64.5kD,表明其为同型二聚体。其等电点为5.70,最适pH值为7.80,最适温度为30℃。在25℃和pH 8.0反应条件下,于甜菜碱醛的米氏常数K_m为67.7μmol/L,最大反应速率V_(max)为78.9μmol/min。K~+、Na~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活性均有很大的影响。 用RT-PCR和RACE技术获得了辽宁碱蓬的CMO和BADH cDNA全序列。CMO cDNA全长1820bp,5′端非编码区123bp,3′端非编码区368bp,含有2个可能的加poly(A)信号:AATTAA、AATAA,开放阅读框架1329个核苷酸,编码一个由442个氨基酸构成的多肽,与菠菜、甜菜、山菠菜CMO的氨基酸序列同源性分别为77%、72%、74%,其中含有成熟肽链起始区“AVA”,具备Rieske-type[2Fe-S]蛋白的保守Cys-His对——“CTH”和“CPYH”,包括保守的多铁原子核结合域“DNYLD”和“HVPYAH”。BADH cDNA全长1901bp,5′端非编码区66bp,3′端非编码区329bp,含有2个可能的加polyA信号:AATAA,开放阅读框架1506bp,编码一个由501个氨基酸构成的多肽,与菠菜、甜菜、山菠菜BADH的氨基酸序列同源性均为88%,其中有醛脱氢酶的保守序列VTLELGGKSP和半胱氨酸残基。 分别克隆了CMO、BADH基因的编码区,构建了它们的植物表达载体pBI121-CMO和pCAMBIA1301-BADH,冻融法将质粒分别导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,获得工程菌LBA4404-pBI121-CMO和LBA4404-pCAMBIA1301-BADH。 农杆菌介导法将CMO和BADH基因分别导入烟草(Nictiana tabacum L.cv.89),获得卡那霉素抗性和潮霉素抗性植株,PCR和Southern杂交均证明外源CMO和BADH基因 大连理工大学博士学位 已整合到烟草基因组中。转基因烟草的甜菜碱含量明显高于对照,转基因烟草叶片膜相 对电导率明显低于对照,说明盐胁迫下转基因烟草的膜结构所受损伤小于对照。转基因 烟草具有一定的耐盐性,转测 基因能在含1.5%NaCI的培养基中正常生长,转BADH 基因能在含1.20NaCI的培养基中正常生长,而对照烟草在含乙00NaCI的培养基中即 停止生长。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q943

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【引证文献】
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