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《大连理工大学》 2003年
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沼泽红假单胞菌RubisCO基因的克隆与表达及其固定二氧化碳特性的研究

杜翠红  
【摘要】:本论文的研究目的是利用基因工程技术构建固定二氧化碳基因工程菌,提高其固定二氧化碳的能力,减少二氧化碳对大气的污染,从而缓解二氧化碳所造成的“温室效应”这一全球性环境问题。 本研究以沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris AS1.2352)为受体菌株,以生物法固定二氧化碳的典型途径----卡尔文循环中的关键酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)的基因为目的基因,借助沼泽红假单胞菌/大肠杆菌穿梭载体,将目的基因转入受体菌株中,构建了一株固定二氧化碳基因工程菌。 首先,对受体菌株AS1.2352的生长特性进行了研究,为构建基因工程菌奠定基础。菌株AS1.2352对氨苄青霉素具有抗性,对四环素和卡那霉素不具有抗性。菌株AS1.2352光照厌氧培养的最佳条件为:光照强度为2000LX,温度为30℃,pH值为7.5。在光合异养条件下,菌株AS1.2352可以利用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、苹果酸、葡萄糖和乙酸钠等多种基质作为营养源,其中,蛋白胨是本研究的最佳底物,底物适宜浓度范围为0.4%-0.5%。在光合自养条件下,菌株AS1.2352生长的最佳培养基组成为:气相,CO_2:H_2=1:9;液相,NH_4Cl浓度为0.5g/L,K_2HPO_4浓度为5g/L,初始pH值为8.5。 建立了气相色谱法测定RubisCO酶活的方法。与分光光度法相比,气相色谱法具有简便、快速、准确、重复性好等优点。从菌株AS1.2352的光合自养培养细胞中提取了RubisCO粗酶液并纯化为电泳级,纯化倍数为14.9,回收率为3.5%,比活为2.347μmol CO_2/mg prot.min,单亚基分子量为50kDa左右。 在质粒pBMP-2的基础上,将沼泽红假单胞菌株DH1的3.0kb的DNA片段进行了亚克隆和测序。结果表明该DNA片段存在一个完整的阅读框架(ORF),即formⅡ RubisCO基因(cbbM),长为1386个核苷酸,共编码461个氨基酸。在结构基因(cbbM)的上游存在一个核糖体结合位点(RBS),下游存在一个转录终止子(terminator),但未发现启动子。在此基础上,通过PCR技术从菌株AS1.2352的染色体DNA中获取了该菌的form Ⅱ RubisCO基因(cbbM),测序结果表明,cbbM基因编码461个氨基酸,与GenBank报道的同种菌的相应序列同源性为99%,与菌株DH1相应序列同源性为100%。以上cbbM基因在大肠杆菌中得到了非融合表达,用SDS-PAGE电泳分析,非融合蛋白分子量约为50kDa左右。 在质粒pBMP-2的基础上,将沼泽红假单胞菌的质粒复制子pMG101克隆到大肠杆菌的质粒pHSG299上,构建了一个沼泽红假单胞菌/大肠杆菌穿梭克隆载体pHSG-MG,该重组质粒可以分别在大肠杆菌和沼泽红假单胞菌中得到复制,为沼泽红假单胞菌基因工程改造奠定了基础。 大连理工大学博士学位论文 通过PCR方法,将沼泽红假单胞菌中的pc划基因的启动子克隆到目的基因cbbM 的上游。然后,将目的DNA片段(包括启动子、核糖体结合位点、结构基因cbbM和 终止子)克隆到沼泽红假单胞菌/大肠杆菌穿梭克隆载体pHSG一MG上,构建了一个沼 泽红假单胞菌表达质粒pHM一CBBM。采用电击法将质粒pHM一CBBM转入沼泽红假单 胞菌株ASI .2352中,构建了一株固定二氧化碳的基因工程菌。该基因工程菌连续繁殖 100代以上,其质粒稳定性为80%。 在光合异养和自养条件下,分别比较了基因工程菌和原始菌株的生长情况,结果表 明在光合异养条件下目的基因在基因工程菌中未得到表达,其生长速度低于原始菌株; 在光合自养条件下,目的基因在基因工程菌中得到了表达,其固定二氧化碳的能力提高 了一倍。在初始二氧化碳浓度为10%时(最佳条件下),推导出基因工程菌的生长动力 学方程。另外,关于基因工程菌对染料的降解情况作了一些初探,为扩大基因工程菌的 应用范围莫定了基础。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:X172

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