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《大连理工大学》 2003年
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人乳铁蛋白基因克隆、表达及转基因动物制备

曹阳  
【摘要】:乳铁蛋白也称乳转铁蛋白,是乳汁中主要的铁结合蛋白,广泛分布于多种组织、细胞内,具有非特异性免疫、参与铁代谢和细胞生长调节等功能。与其它动物乳铁蛋白相比,人乳铁蛋白更适于人类食用,为了满足需求,应选择合适的系统,进行人乳铁蛋白基因的异源表达。目前常用的表达系统中,动物乳腺是人乳铁蛋白基因表达较为合适的器官。因此,我们克隆了人乳铁蛋白cDNA,构建了乳腺特异表达载体,在小鼠乳腺癌细胞和个体内进行了表达,并利用精子载体法尝试了转基因兔、转基因羊的制备。 首先利用RT-PCR方法从人乳腺组织中扩增出乳铁蛋白cDNA序列;PCR扩增了800bp的山羊β-乳球蛋白基因5′端调控序列。通过同源序列-PCR扩增方法连接得到的片段,酶切后克隆到表达载体中,获得人乳铁蛋白基因乳腺特异表达载体pLNCXHLF。 脂质体包裹pLNCXHLF,转染小鼠乳腺癌细胞MA-782,通过G418、PCR筛选获得阳性单克隆细胞。阳性细胞用海藻酸钠包埋培养,加入激素诱导,检测结果表明:培养液上清含有人乳铁蛋白,分子量为34KD,最高含量为65mg/L/10~5细胞;重组人乳铁蛋白具有抑制E.Coli JM109生长的作用,同时具有与铁离子结合的特性。 质脂体包裹重组质粒注入到小鼠睾丸中,与正常母鼠交配产生的后代,经PCR、Southern检测,部分子鼠含有外源基因。阳性母鼠产子后,乳汁中含人乳铁蛋白,与天然蛋白具有相同的迁移率,含量为 摘要 4 .8一6.79/Lo 重组质粒经质脂体包裹,注入到兔和羊的皋丸或输精管中,后代 PCR、Southern检测表明,部分个体含有外源基因。翠丸注射兔产生转 染精子时间较长,注射后七个月的附皋精子仍可检测到外源基因。输精 管注射得到3只流产羊,外源基因在11种组织中分布不同,表明得到的 个体为转基因嵌合体。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q786

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