成骨细胞玻璃化冷冻保护剂的研究

【摘要】：骨移植用于修复外伤、囊肿、良性和恶性肿瘤、以及先天畸形造成的骨缺损。自体移植受到患者病情、增加创伤和移植数量的限制，新兴的组织工程骨可解决这一问题。然而，这些活体材料的保存和贮藏是临床应用的主要障碍之一。相对于慢速冷冻法，玻璃化法操作简单，由于可以同时防止细胞内外冰晶的形成，因而对细胞和组织所造成的损伤更小。但玻璃化法采用的高浓度玻璃化溶液不可避免地会造成化学毒性损伤和渗透压损伤。现已应用玻璃化法成功地进行了多种细胞的保存，但玻璃化法保存成骨细胞的研究在国内外文献中还未见报道。 本文的研究目的是筛选适合成骨细胞的玻璃化溶液组成，为成骨细胞及骨组织玻璃化保存提供有价值的参考知识。 首先选用三种渗透性冷冻保护剂：二甲基亚砜(DMSO 45％w／w)、2，3-丁二醇(BD 32％w／w)和1，2-丙二醇(PD 45％w／w)，分别用低温显微镜系统和差示量热扫描仪(DSC)观察其玻璃化能力和现象，并确定其低温断裂温度、玻璃化转变温度和浓度。为降低渗透性玻璃化溶液的浓度，用糖类非渗透性冷冻保护剂一海藻糖、蔗糖、葡萄糖代替一部分渗透性冷冻保护剂，并用低温显微系统观察其玻璃化能力，从而确定实验用的玻璃化溶液的浓度。研究结果表明：除BD(40％w／w)玻璃化浓度高于文献报道外，DMSO和PD均与文献相符。采用糖类能够降低渗透性保护剂的浓度，溶液也可以实现玻璃化。另外，快速冷冻易于抑制溶液中冰晶的生长，可以达到较好的玻璃化效果。本实验采用的玻璃化溶液在冷冻过程中都不同程度地出现了低温断裂现象。断裂温度低于玻璃化转变温度，为避免玻璃体断裂对细胞和组织产生的损伤，推荐以不产生低温断裂的冷冻速率降温到介于其玻璃化转变温度和低温断裂温度之间的某一温度，并在此状态保存。 选定了玻璃化溶液后，先确定玻璃化溶液对成骨细胞活性影响的实验方法：0～4℃，在成骨细胞中导入玻璃化溶液，平衡5min，室温下(～20℃)用培养基分两次洗脱后，接种到孔板中培养，培养24hr后，用MTT比色法检测细胞活性。用此实验方法，比较渗透性玻璃化溶液，PD中加入糖类的玻璃化溶液和DMSO中加入糖类的玻璃化溶液对成骨细胞活性的影响。结果表明：三种渗透性冷冻保护剂单独使用时，细胞成活率都很低，在10％左右，说明三种渗透性冷冻保护剂单独使用对细胞的毒性都很大。在PD中加入糖类，对细胞成活率没有显著提高，而在DMSO中加入糖类，显著提高了细胞成活率。其中，以39％DMSO+6％海藻糖的效果最好，成活率达到46.4％。 成骨细胞玻璃化冷冻保护剂的研究 利用K一K模型模拟计算了单浓度一次性导入和多浓度分步导入冷冻保护 剂对成骨细胞体积的变化。结果表明:单浓度一次性导入时，随着冷冻保护剂 浓度的增大，冷冻保护剂的渗透速度加快，出现最大体积变化的时}，e]缩短;而 且，细胞体积变化也随之增大，对细胞产生的损伤增大。采用多浓度分步导入 冷冻保护剂能够降低单浓度一次性导入玻璃化冷冻保护剂对细胞体积产生的 骤变。PD与DMSO相比，PD比DMSO的渗透速度更快，出现最大体积变化 的时间更短;而且，PD导入过程中细胞体积变化的最大值也高于DMSO导入 过程中的体积变化最大值。