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喜树细胞培养体系的建立与喜树异碱A和B的生物合成及过程调控

于放  
【摘要】:以喜树的根、茎及叶为外植体共诱导出六种愈伤组织。通过高效液相色谱和质谱分析,确定了具有合成喜树异碱(ICPT)A和B能力的四种愈伤组织,并通过改变激素配比等策略,对喜树愈伤组织生长、ICPTA和ICPTB的合成以及愈伤组织的状态进行了调控,成功地获得了适合悬浮培养的愈伤组织,并建立起喜树细胞悬浮培养系。喜树细胞悬浮培养系是由尺度主要集中在2-4mm的细胞团颗粒组成,除在对数生长期有一定的单细胞外,细胞主要是以细胞团颗粒的形式存在于培养液中。通过培养液中的激素组成和配比的不同组合,得出了最佳激素浓度配比为2,4-D 0.15 mg l~(-1)+BA 0.6 mg l~(-1)。 系统研究了喜树细胞悬浮培养的动力学规律,结果表明,从培养工艺上看细胞生长大致可分为指数生长期、恒速生长期及减速生长期三个阶段,培养周期约为15天,最大生物量达到18.37 g l~(-1),相应的ICPTA和ICPTB的含量分别为3.67%和1.33%。在此基础上考察了接种量及接种物“年龄”对喜树细胞生长时间进程的影响,以胞内磷酸盐含量为参数来表征喜树细胞“年龄”,并得以验证。建立了用于描述喜树细胞生长、基质消耗以及产物生成的动力学方程,用来描述喜树细胞悬浮培养的动力学特征,并对一定范围内接种量以及初始胞内磷酸盐含量对细胞生长的影响进行了拟合。 研究了外源水杨酸对喜树细胞抗性反应的诱导,并在此基础上考察了外源水杨酸以及稀土元素La~(3+)的加入对ICPTA和ICPTB生物合成的调控作用。结果表明,外源水杨酸的添加能有效的诱导喜树细胞的抗性反应。浓度为1 mg l~(-1)的水杨酸在细胞培养的第9天加入,使ICPTA和ICPTB的含量分别提高到4.003%和1.524%,此时ICPTA和ICPTB的产率分别为0.509 g l~(-1)和0.194 g l~(-1)。稀土元素La~(3+)在一定浓度范围内对喜树细胞的生长和ICPTA和ICPTB的积累均有促进作用,浓度为20 μ M的La~(3+)在细胞接种时加入,此时所获得的最终生物量为20.42 g l~(-1),ICPTA和ICPTB的含量分别为3.995%和1.496%,ICPTA和ICPTB的产率分别为0.616 g l~(-1)和0.231 g l~(-1)。两种调控机制组合运用能有效地提高ICPTA和ICPTB在细胞内的积累,使得ICPTA和ICPTB的产率分别达到0.663 g l~(-1)和0.237 g l~(-1)。与未做调控的对照组比较,喜树异碱A和B的产率分别提高了35.31%和33.15%。


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