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《大连理工大学》 2006年
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小球藻外源基因转化系统的建立及其表达植酸酶的研究

王逸云  
【摘要】:本文在国内外首次报道了植酸酶基因在海水小球藻(Chlorella sp.MACC/C95)中的稳定表达。以营养丰富的海水小球藻作为生物反应器来生产植酸酶,直接作为一种无毒无害的绿色饲料添加剂,可避免复杂的提纯分离工艺,具有广阔的开发前景和潜在的经济价值。本论文首先测定了海水小球藻对10种抗生素的敏感性,确定了小球藻基因工程适用的抗生素筛选标记。并以抗生素为除菌工具,获得了无菌的小球藻藻株,优化了无菌小球藻的培养条件。然后以无菌的海水小球藻完整细胞为受体,以gus基因作为报告基因,优化了电击转化条件。在此基础上,将植酸酶基因转入小球藻中,获得了转基因藻株。这不仅为低成本生产植酸酶,使其得以广泛应用,创造更大的经济效益和社会效益打下了基础,同时也为藻类生物反应器的建立及广泛应用开辟了道路。具体研究内容及结果如下: 1、研究了海水小球藻对10种常见抗生素的敏感性及淡化培养对小球藻生长的影响,并测定了潮霉素、G418、氯霉素、Zeocin对小球藻在海水培养基和淡化十倍培养基中的半致死剂量。实验结果表明,小球藻对卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、头孢霉素、链霉素都不敏感,这几种抗生素在实验范围内不对小球藻的生长产生明显抑制;小球藻对潮霉素较敏感,对G418则很敏感,对氯霉素、Zeocin极敏感。淡化十倍培养对小球藻的生长没有显著影响,且能使小球藻对抗生素的敏感性大为提高。G418适合作为小球藻基因工程的选择试剂,其在固体培养基中的适宜筛选浓度为140.5μg/mL。 2、研究了以抗生素为除菌工具,建立小球藻无菌培养体系的途径。首先测定了小球藻培养液中的细菌对小球藻不敏感的6种抗生素的敏感性,然后研究了适于小球藻除菌的抗生素组合和处理浓度及加入抗生素对小球藻和细菌生长的影响。结果表明小球藻培养体系中的细菌对庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素非常敏感,利用涂平板挑单克隆法去除霉菌后,将这五种抗生素均以终浓度100μg/mL加入小球藻培养体系中,处理两次,获得了无菌的小球藻藻株。进一步研究了接种密度、光强、pH和温度对小球藻生长的影响,并在无菌培养条件下,对影响无菌小球藻生长的五种主要营养因素:NaHCO_3、KNO_3、K-H_2PO_4、VB_1、VB_(12)进行了优化。得到小球藻适宜的培养条件为:初始接种浓度取藻体细胞数为4.27×10~6个/mL左右;pH范围在10左右;培养温度为25±0.5℃;光照强度约为3.0×10~3~1.0×10~41x。通过五因素四水平正交实验,得到适于无菌小球藻生长的优化培养基配方为:KNO_3 0.5g/L、NaHCO_3 0.2g/L、VB_(12)1.0μg/L、KH_2PO_4 0.02g/L、VB_1 0.3mg/L。该优化配方加上f/2微量元素后具有
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q943.2

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前4条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【相似文献】
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6 记者 任荃;功能食品可治“病”[N];文汇报;2002年
7 农科生;农科院研制成功富含植酸酶的玉米品种[N];农资导报;2007年
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10 本报记者 李莺;照片级打印机离实用有点远[N];中国消费者报;2003年
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