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《大连理工大学》 2008年
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Enterobacter sp. LY402生物降解多氯联苯的产物及相关基因分析

郑蔼萍  
【摘要】： 多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是环境中一种重要的有机氯代污染物，其物理化学性质稳定，难于生物降解。本实验室分离驯化出一株对高氯代和共平面的PCBs都具有较高降解能力的菌株Enterobacter sp.LY402。本论文鉴定了LY402生物降解多氯联苯的产物并解析了相关的降解基因，获得了如下研究成果： (1)利用GC-MS、GC-ECD等分析方法，鉴定Enterobacter sp.LY402降解PCBs产生的中间代谢物为氯代苯甲酸。单一PCB同类物2，2′-／2，3-二氯联苯降解分别生成2-氯苯甲酸和2，3-二氯苯甲酸，PCBs混合物Aroclor1242降解后生成至少8种氯代苯甲酸，包括2种单氯代，4种二氯代和2种未知的三氯代苯甲酸。 (2)使用氯化银比浊法分析氯离子浓度，确定Enterobacter sp.LY402降解2，2′-二氯联苯过程中有氯离子逐渐释放出来。 (3) Enterobacter sp.LY402对2μg／ml的7种单氯代和二氯代苯甲酸混合物的降解效果表明，该菌株对PCBs的代谢产物一某些取代位点的氯代苯甲酸也有一定的降解能力。3．氯苯甲酸2天降解100％，2-氯苯甲酸，4-氯苯甲酸和3，5-二氯苯甲酸7天分别降解34％、18％和12.3％。 (4)质粒提取及电泳结果表明，Enterobacter sp.LY402中含有一个20kb左右的质粒pLYZ402，质粒消除与转化实验表明，该质粒与LY402降解多氯联苯的能力有关。 (5)根据同源性设计引物，通过PCR的方法扩增了Enterobacter sp.LY402中PCBs相关降解基因，获得了11kb的bph基因簇的几乎全部的基因序列，证实该基因簇位于质粒pLYZ 402上。同源分析表明，Enterobacter sp.LY402的bph基因簇基因序列和排列顺序与Burkholderia xenovorans LB400几乎完全相同，只是LY402的质粒大小仅是LB400的约百分之一。这一结果不仅解释了LY402与LB400降解能力及底物选择上的相似性，同时也说明在野生状况下，携带降解基因的质粒可能具有很好的移动能力。 (6)进一步根据LB400中的氯代苯甲酸降解基因设计引物分离Enterobacter sp.LY402中的同源基因，未能获得相关结果，说明氯代苯甲酸降解基因与LB400的同源性可能不高，相关基因的分离还需要进一步的研究。 以上研究结果表明，Enterobacter sp.LY402通过bph途径降解PCBs，产生氯代苯甲酸，并释放出氯离子，某些生成的氯代苯甲酸还可继续被降解；12个降解相关基因位于20kb的降解质粒pLYZ 402上，形成11kb大小的基因簇，序列与LB400高度同源。
【关键词】：多氯联苯 氯代苯甲酸 生物降解 bph基因簇
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：X50
【目录】：
  • 摘要4-5
  • Abstract5-10
  • 引言10-12
  • 1 文献综述12-35
  • 1.1 引言12
  • 1.2 多氯联苯简介12-15
  • 1.2.1 多氯联苯的性质12-13
  • 1.2.2 多氯联苯的污染状况13
  • 1.2.3 多氯联苯的毒性13-15
  • 1.3 多氯联苯的微生物修复15-22
  • 1.3.1 微生物修复与其它修复方式的比较15-16
  • 1.3.2 PCBs好氧降解研究进展16-20
  • 1.3.3 PCBs厌氧降解研究进展20-21
  • 1.3.4 PCBs厌氧-好氧协同作用21-22
  • 1.4 多氯联苯好氧降解的途径及相关酶系22-31
  • 1.4.1 上游降解途径22-27
  • 1.4.2 氯代苯甲酸降解途径27-31
  • 1.5 多氯联苯好氧降解的相关基因及调控31-35
  • 1.5.1 上游降解途径相关基因及调控31-33
  • 1.5.2 氯代苯甲酸降解相关基因及调控33-35
  • 2 Enterobacter sp. LY402降解PCBs产物分析35-51
  • 2.1 引言35
  • 2.2 仪器与试剂35-36
  • 2.2.1 实验试剂35-36
  • 2.2.2 实验仪器36
  • 2.3 实验方法36-41
  • 2.3.1 培养基的配制36-38
  • 2.3.1.1 LB培养基36-37
  • 2.3.1.2 合成培养基37
  • 2.3.1.3 无氯离子培养基37-38
  • 2.3.2 降解菌LY402的复壮及驯化38
  • 2.3.3 降解体系的制备38-39
  • 2.3.3.1 用于降解率计算的降解体系38
  • 2.3.3.2 用于代谢物分析的降解体系38-39
  • 2.3.4 样品处理39-40
  • 2.3.4.1 PCBs降解分析样品的处理39
  • 2.3.4.2 PCBs代谢产物分析样品的处理39
  • 2.3.4.3 氯代苯甲酸降解样品的处理39
  • 2.3.4.4 脱氯样品的处理39-40
  • 2.3.5 样品分析40-41
  • 2.3.5.1 二氯代联苯的GC分析40
  • 2.3.5.2 Aroclor1242的GC分析40
  • 2.3.5.3 代谢产物的GC-MS定性分析40
  • 2.3.5.4 氯代苯甲酸的GC分析40
  • 2.3.5.5 分光光度法分析氯离子40-41
  • 2.4 实验结果及讨论41-50
  • 2.4.1 二种PCB同类物降解产物定性分析41-44
  • 2.4.2 二种PCB同类物降解产物定量分析44-46
  • 2.4.3 PCBs混合物Aroclor1242降解产物定性定量分析46-48
  • 2.4.4 PCBS降解过程中脱氯的考察48-50
  • 2.5 小结50-51
  • 3 Enterobacter sp. LY402降解PCBs相关基因解析51-66
  • 3.1 引言51
  • 3.2 仪器与试剂51-52
  • 3.2.1 实验试剂51
  • 3.2.2 实验仪器51-52
  • 3.3 实验方法52-57
  • 3.3.1 培养基的配制52
  • 3.3.1.1 液体培养基52
  • 3.3.1.2 固体培养基52
  • 3.3.2 降解菌LY402的培养52
  • 3.3.3 质粒提取52-55
  • 3.3.3.1 碱裂解法提取质粒52-54
  • 3.3.3.2 琼脂糖凝胶电泳分析54-55
  • 3.3.4 质粒转化55-56
  • 3.3.4.1 氯化钙法制备感受态细胞55
  • 3.3.4.2 热激法转化55-56
  • 3.3.4.3 筛选56
  • 3.3.5 降解基因的分离56-57
  • 3.3.5.1 PCR引物设计56
  • 3.3.5.2 PCR反应条件56-57
  • 3.3.5.3 PCR产物回收测序57
  • 3.4 实验结果及讨论57-65
  • 3.4.1 质粒的大小及功能研究57-59
  • 3.4.2 bph途径相关基因的分离59-63
  • 3.4.3 氯代苯甲酸降解相关基因分离的初步研究63-65
  • 3.5 小结65-66
  • 4 结论与展望66-67
  • 4.1 主要结论66
  • 4.2 展望66-67
  • 参考文献67-72
  • 附录 A Enterobacter sp. LY402代谢Aroclor1242产物质谱图72-75
  • 附录 B Enterobacter sp. LY402 bph基因簇序列75-79
  • 攻读硕士学位期间发表学术论文情况79-80
  • 致谢80-81

【参考文献】
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