草酸盐高效降解菌的筛选及其酶学性质研究

【摘要】： 草酸盐降解菌及其降解酶的研究具有很多潜在的应用价值。一方面可用于致病真菌Sclerotinia sclerotiorum所引起的重要经济作物菌核病的防治，及抗病性转基因植物的生产：另一方面，草酸盐降解酶被用于诊断和治疗与草酸盐相关的疾病，如肾结石，以及环境的生物治理。本论文分离筛选出具有较强草酸盐降解能力的新菌，并对该菌降解酶的酶学性质及降解机理进行了研究。 在酸性介质中草酸能够催化重铬酸钾对次甲基蓝的氧化脱色反应，这种催化效率与草酸浓度呈正相关，据此建立了次甲基蓝-重铬酸钾体系测定草酸的方法。实验证明，在660 nm处不加草酸与加草酸的次甲基蓝-重铬酸钾体系反应后的吸光度差值△A在0～80μg／mL范围内与草酸浓度呈线性关系，线性方程为：△A=0．0984ρ_(草酸)-0．0044，相关系数为0．9986。反应的最适条件为3．752×10~(-5)mol／L次甲基蓝、0．12mol／L H_2SO_4和2×10~(-3)mol／L K_2Cr_2O_7。 以草酸盐为唯一碳源和能源，从土壤中分离筛选获得一株能够降解草酸及其盐类的细菌，命名为OXJ-11。该菌在形态培养基形成的菌落为乳白色，圆形；革兰氏阴性染色为阴性杆菌；经电镜观察，为端生双鞭毛。接触酶阳性：不还原硝酸盐。能够在温度25℃-35℃范围内和pH6．0-10．0范围内好氧生长。根据其形态特征、生理生化特征及16SrRNA序列同源性分型，OXJ-11为Pandoraea属的一株新菌。这种菌能够合成草酸盐降解酶。OXJ-11产酶的最适发酵培养基配方为：0．5％草酸钠，0．3％酵母浸粉，0．05％MgSO_4·7H_2O，最适温度为30℃，pH为6．0-7．0。 Pandoraea sp.OXJ-11的草酸盐降解酶为底物草酸盐诱导酶。以次甲基蓝-重铬酸钾氧化还原法测定反应体系草酸盐的减少量，建立了草酸盐降解酶的酶促反应体系。该酶为胞壁酶，超声破碎的条件为：输出功率200w-300w，超声破碎0．5s、间歇5s，破碎总时间7min。草酸盐降解酶的最适初始底物浓度为0．7mg／mL；最适反应温度为30℃；30℃下保温酶活力较稳定；酶反应的最适pH范围较宽为5．5-8．0；粗酶液在pH7．0-8．0范围内保温比较稳定；不同浓度的Fe~(2+)和Cr~(3+)对酶均有抑制作用；SDS对酶有很强的抑制作用；10mmol／L的Mg~(2+)对酶有一定的激活作用；NaCl对酶活力有较大的影响，0．15mol／L NaCl可使酶活力下降约50％，浓度达到0．3mol／L时酶活力完全丧失。 草酸盐降解酶的酶解产物之一为二氧化碳，当反应体系中含有阳离子时，二氧化碳会与阳离子反应生成碳酸盐。而过氧化氢不是酶反应产物。甲酸盐为酶解反应的另一产物，但由于OXJ-11菌中含有甲酸盐脱氢酶，因此，甲酸盐被进一步降解生成二氧化碳。OXJ-11菌的草酸盐降解酶所催化的反应，必须在有氧条件下才能进行。草酸和琥珀酸为草酸盐降解酶的可替换底物。ATP和ADP对草酸钠降解酶活性均有不同程度的抑制作用。