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《大连理工大学》 2009年
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菌株Dyella ginsengisoli LA-4降解联苯及基因的克隆与表达

李昂  
【摘要】: 本论文旨在考察1株新分离的Dyella属菌株LA-4对联苯的降解特性并对其代谢基因进行分子遗传学研究。对菌株LA-4进行生理生化、Biolog分析及16S rDNA分子鉴定,考察其生长及降解联苯的特性,推测出菌株LA-4降解联苯的途径;将该菌株作为生物强化制剂进行生物强化降解联苯的研究,采用PCR-DGGE分子指纹技术对强化体系进行微生物群落动态解析;利用染色体步移法扩增得到完整的bph基因簇,并对其中的bphA1A2、bphA3、bphA4、bphB、bphC和mfphA基因进行克隆和表达。 菌株LA-4是一株新的联苯降解菌,结合生理生化鉴定、菌株的形态观察、Biolog鉴定及16S rDNA序列分析,菌株LA-4归属于变形细菌Y亚类,Dyella属ginsengisoli菌种。菌株LA-4已作为专利菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心,注册编号为:CGMCC No.2723。菌株LA-4与Dyella ginsengisoli Gsoil 3046T(=DSM 18387T)的16SrDNA序列相似性高达98.22%,其16S rDNA序列登录GenBank,注册号为:EF191354。 菌株LA-4对卡那霉素和链霉素具有抗性,对其它所试抗生素均无抗性。菌株LA-4的最适生长与降解条件为30℃,pH=6.0,摇床转速为150 r/min。加入的表面活性剂Tween-80浓度小于40 mg/L时会促进菌株LA-4对联苯的降解;菌株在生长降解过程中可以耐受3%的盐度;菌株具有抗金属离子Zn~(2+)的能力。菌株LA-4的粗酶具有2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶活性,且为组成酶。联苯在菌株LA-4的作用下,有黄色中间产物产生,苯环发生了间位断裂反应。LC-MS分析中检测到主要降解中间产物为2-羟基-6-氧-6-苯基己二烯酸(HOPDA)和苯甲酸。 将菌株LA-4的游离态细胞投加到联苯处理系统中进行生物强化降解研究,结果表明投加菌株LA-4的游离态细胞可以缩短处理系统的启动时间,投加不同接种量对强化效果有显著影响,投配比为3.96%的系统显示出最强的处理效果,在进水联苯浓度为500-1000 mg/L时,处理效果稳定。利用PCR-DGGE对强化体系进行微生物群落动态解析,结果表明活性污泥体系和投配比为1.98%的系统随着体系的不断运行,微生物的多样性逐渐降低;当进水联苯浓度逐渐升高时,投配比为1.98%的系统中,强化菌逐渐消失。而在投配比为3.96%的系统中可证明体系中始终有强化菌LA-4的存活。 利用染色体步移的方法从菌株LA-4的基因组DNA中扩增得到完整的bph基因簇,全长为12,186 bp,全序列登录GenBank,序列号为EU258607。对整个基因簇进行解析,结果表明基因排列顺序为bphA1A2-ORF1-bphA3A4BCXOX1-ORF2-bphX2X3D,其中12个基因出现在已报道的bph基因簇中,ORF2基因首次在bph基因簇中发现,位于6phX1和bphX2基因之间。根据基因排列特点,说明其属于LB400型bph基因簇。ORF2基因与菌株Pseudomonas putida UCC22(BAB62053)中编码2-羟基粘康酸半醛水解酶(2-hydroxymuconic semialdehyde hydrolase)的基因相似性最高,确定其为编码芳环间位断裂产物水解酶的基因,命名为mfphA。菌株LA-4中的联苯降解酶与其他已知的相应酶的氨基酸序列相似性较低,最高相似性均在63-89%之间。 将bphA1A2、bphA3、bphA4、bphB和bphC基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。菌株LA-4联苯双加氧酶(BPDO_(LA-4))基因的表达产物能够转化联苯/多氯联苯等物质,以联苯为底物时,酶的比活性最高,为134.9 nmol NADH/min(mg protein)。BPDO_(LA-4)对底物的选择性按以下顺序:联苯>4-氯联苯>2,5-二氯联苯>2,2′-二氯联苯>2,5,2′-三氯联苯>3,3′-二氯联苯>2,5,3′-三氯联苯>4,4′-二氯联苯>2,5,4′-三氯联苯。实验中未检测到联苯双加氧酶转化2,2′,5,5′-四氯联苯的活性。实验表明BPDO_(LA-4)还具有转化二苯并呋喃和黄烷酮的活性。通过GC-MS和紫外可见光谱分析确定了菌株LA-4的联苯双加氧酶在转化联苯及多氯联苯时仅存在2,3-位双加氧活性,而未发现其具有3,4-位加氧活性。 通过对BphC LA-4的氨基酸序列分析,说明BphC LA-4为双域的Ⅰ类Fe(Ⅱ)依赖型外二醇双加氧酶。利用A|¨KTA蛋白质层析仪对bphC基因在大肠杆菌中的表达产物进行纯化。纯化后的BphC LA-4可以催化邻苯二酚类物质的间位开环反应,以2,3-二羟基联苯为底物时,酶的比活最高,为118.3 U/mg,酶反应的最适pH为8.0,最佳温度为40℃。BphC_LA-4对催化底物的选择性按以下顺序:2,3-二羟基联苯>3-甲基邻苯二酚>邻苯二酚>4-氯邻苯二酚>4-甲基邻苯二酚。 根据MfphA的氨基酸序列分析和三级结构模拟的结果,说明mfphA基因所编码的酶属于α/β水解酶家族,可以在单环芳香化合物降解过程中水解芳环间位开环产物。将mfphA基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并利用A|¨KTA蛋白质层析仪对表达产物进行了纯化。纯化后的MfphA可以水解单环芳香化合物间位断裂产物,以2-羟基-6-氧-2,4-己二烯酸(HODA)为底物时酶的比活性最高,为2.0 U/mg;酶反应的最适pH为7.0,最佳温度为70℃,可以长期于低温下保存。MfphA对催化底物的选择性按以下顺序:6-methyl-HODA>HODA>5-methyl-HODA>6-phenyl-HODA>5-chloro-HODA。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:X172

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3 郭静波;生物菌剂的构建及其在污水处理中的生物强化效能[D];哈尔滨工业大学;2010年
4 秦华明;高效油脂降解菌的筛选及其对油脂废水的强化处理研究[D];华南理工大学;2003年
5 李安政;香菇交配型因子次级重组体及与交配型因子连锁的分子标记的鉴定[D];华中农业大学;2006年
6 刘卫东;Pseudomonas putida DLL-E4 1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶的晶体结构及两种农药降解相关酶的蛋白质晶体学研究[D];南京农业大学;2010年
7 袁军;印度洋深海多环芳烃降解菌的多样性分析及降解菌新种的分类鉴定与降解机理初步研究[D];厦门大学;2008年
8 夏颖;多环芳烃菲对微生物生态毒理研究、菲降解菌的分离鉴定及降解基因克隆与表达[D];浙江大学;2004年
9 骆苑蓉;多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究[D];厦门大学;2008年
10 钟文辉;2,4-二氯酚的微生物降解及相关基因的克隆[D];浙江大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郭子瑞;糖蜜废水制氢系统的调控及其生物强化[D];东北林业大学;2011年
2 贾玉红;菌株Dyella sp.LA-4降解底物广谱性及其在土壤修复中的应用[D];大连理工大学;2009年
3 毕洪凯;高效苯胺降解细菌GXA7的筛选鉴定及其苯胺双加氧酶基因簇的克隆[D];广西大学;2004年
4 王立华;菲降解中度嗜盐菌群降解特性及萘双加氧酶基因表达的研究[D];内蒙古大学;2010年
5 许隽波;五氯酚厌氧降解菌的分离筛选及其在CSTR中的生物强化运行[D];哈尔滨理工大学;2010年
6 陈威;发酵法产邻苯二酚菌株的筛选及固定化细胞的条件优化[D];广西大学;2007年
7 代沁芸;邻苯二甲酸二丁酯的生物降解以及土壤中关键细菌群落动态解析[D];中南大学;2010年
8 杨帅;一株N,N-二甲基甲酰胺降解菌的特性及其在SBR系统中的生物强化作用[D];南京农业大学;2011年
9 张鹏;石油降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究[D];山东师范大学;2006年
10 李娟;石油降解性质粒的提取及c23O基因的克隆与表达[D];哈尔滨工业大学;2007年
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