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大豆子房滴注转化方法的研究及耐盐基因(AlNHX1)的转化

刘建凤  
【摘要】: 植物转基因技术的迅速发展对传统的作物育种已产生了深刻的影响,而转基因作物的安全性越来越受到人们的重视,其中筛选标记基因和载体骨架序列是影响转基因作物安全性评价的重要因素。基因枪和农杆菌转化法目前均较难实现无载体骨架序列无选择标记基因的转化,而花粉管通道法不仅可以解决该问题,且能避免大豆组织培养困难的技术瓶颈,但是缺点是转化率偏低、重复性较差。同时栽培大豆(Glycine max.)属于中度耐盐植物,盐胁迫条件下,种子的发芽率、幼苗的生长、结瘤数量以及干物质积累都受到抑制,从而导致产量降低。如果通过植物基因工程技术将耐盐基因导入大豆,就有可能培育出耐盐大豆新品种,改善大豆的耐盐性,提高大豆的耐盐能力。 为了解决转基因大豆的生物安全性问题并提高转化率,本研究在花粉管通道法的基础上进一步优化了大豆子房滴注法。通过苯胺蓝染色观察花粉管,FITC荧光标记示踪外源DNA以及无载体骨架序列无选择标记smGFP基因元件(35SCaM启动子-smGFP表达框-Nos终止子)导入大豆等方法,确定了大豆子房滴注法的适宜剪切位置为完全去除花柱、转化时间为自花授粉后6~8 h,缓冲液为0.05%Silwet L-77+8%蔗糖。在此条件下转化大豆,转化率达到3.18%。Southern杂交结果表明smGFP基因已整合到大豆基因组中。对转smGFP基因大豆幼胚的荧光观察结果表明,smGFP基因已在转基因大豆幼胚中表达,PCR检测以及Southern杂交等结果表明外源基因可以遗传给后代。 为了验证大豆子房滴注法的可重复性与遗传稳定性,本研究将无载体骨架序列无选择标记GUS基因元件导入大豆。对转化植株的幼胚进行GUS组织化学染色结果表明,在检测的340个幼胚中有12个呈GUS阳性,转化率为3.53%;对转化植株的PCR检测结果表明,在180个转化植株中有6个呈PCR阳性,转化率为3.33%。Southern杂交表明外源GUS基因元件已整合到大豆基因组中。对后代叶片GUS染色、PCR检测及Northern杂交结果表明外源基因可以遗传并表达,其中一个株系符合孟德尔分离规律。 为了获得具有生物安全性的耐盐大豆材料,本论文采用已优化好的子房滴注法将无载体骨架序列无选择标记的AINHX1基因元件导入大豆。对200个转化样品的PCR检测结果表明,6个样品呈阳性,PCR检测阳性率为3.0%。Southern和Northern杂交检测结果表明,外源基因AINHX1已整合到大豆基因组中并表达。 转基因大豆T_1代植株PCR检测与Southern杂交结果表明外源AINHX1基因元件遗传给了后代,选取部分阳性植株进行耐盐生理实验结果表明,转基因大豆的各项指标均明显好于野生型大豆。在盐胁迫下(150mM NaCl),转基因大豆根中Na~+含量比野生型高29%,而叶片中比野生型低21%;在叶片与根中转基因大豆K~+含量是野生型的2倍左右,从而维持了叶片中相对较高的K~+/Na~+比值;在盐胁迫下,转基因植株相对含水量比野生型高9%,渗透势低39%,表明转基因大豆具有较好的吸水和保水能力;在盐胁迫下,转基因大豆的叶绿素含量与光合速率分别高25%与94%;在盐胁迫下,超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化物酶(POD)活性比野生型大豆分别高45%与69%。以上实验结果表明获得了耐盐性有所提高的大豆。 本研究优化了一种转化率较高、重复性较好的大豆子房滴注法,通过该方法将无载体骨架序列无选择标记的AINHX1基因元件导入大豆,提高了大豆的耐盐性,为其它功能基因在大豆转化中的应用奠定了基础。


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