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《大连理工大学》 2009年
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亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因克隆、分离纯化和性质表征

刘田  
【摘要】:β-N-乙酰己糖胺酶(EC 3.2.1.52)广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,负责水解多种糖复合物中以β-糖苷键连接的β-N-乙酰葡萄糖胺和β-N-乙酰半乳糖胺。昆虫β-N-乙酰己糖胺酶由多个基因编码,参与几丁质降解、N-糖基化修饰、糖复合物降解以及配子结合等生理过程。几丁质是由β-N-乙酰-D-葡萄糖胺(β-N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)以β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖。由于几丁质是昆虫重要的结构组分但在高等动植物体内没有分布,因此如果昆虫体内存在专一性参与几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶,那么对该酶的选择性抑制将为农业害虫防治提供新的思路。本研究旨在鉴定农业害虫亚洲玉米螟体内专一性参与几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶,为绿色农药的开发提供新的理论参考;同时对该酶性质和机理的表征也能够扩展对于β-N-乙酰己糖胺酶乃至糖基水解酶的认识。论文的主要研究工作包括: (一)亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列及转录水平研究 (1)根据已知昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的保守片段设计引物,采用RT-PCR及RACE的方法从亚洲玉米螟五龄幼虫总RNA中获得编码β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列(OfHEXl),全长为2593 bp,编码594个氨基酸,Genbank登录号为DQ887769.1; (2)通过与已知晶体结构的β-N-乙酰己糖胺酶进行多重序列比对发现,Glu~(355)、Asp~(240)、His~(294)、Asp~(354)、Tyr~(450)和Trp~(424)等关键氨基酸残基在OfHEXl编码的氨基酸序列中均保守。OfHEXl编码的氨基酸序列与植物、鸟类和哺乳动物的β-N-乙酰己糖胺酶的一致性均为30%左右,但是与其它昆虫β-N-乙酰己糖胺酶的同源性在27%-76%之间。系统树分析显示,昆虫β-N-乙酰己糖胺酶可分为4个分支,推测分别对应不同的生理功能。OfHEXl属于分支Ⅳ,其同源性在48%-76%之间。该分支中的部分成员在几丁质降解过程中发挥作用。 (3)利用RT-PCR和Real-time PCR两种方法研究OfHEXl在亚洲玉米螟不同生长发育时期的转录水平。发现OfHEXl在昆虫蜕皮、成蛹和羽化等生长发育时期其转录水平上调。推测OfHEXl参与其变态过程中的几丁质降解。 (二)亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的纯化 采用SOURCE30Q阴离子交换层析、CHT羟基磷灰石层析、MonoQ阴离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析等4步柱层析方法,从亚洲玉米螟五龄幼虫中分离纯化了β-N-乙酰己糖胺酶(OfHexl),产量为0.47 mg/300头幼虫,活力回收率为19.67%,纯化倍数为1468倍。纯化后的OfHexl经SDS-PAGE分析为单一条带,经高分辨率凝胶过滤层析分析为单峰。 (三)亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的生物化学性质表征 (1) OfHexl的分子量和组成方式。在变性条件下,SDS-PAGE和MOLDI-TOF MS测定其分子量分别为68 kDa和67.0±0.3 kDa。非变性条件下,凝胶过滤层析确定其分子量为128 kDa。该酶是以同源二聚体的形式存在并以非共价的形式结合。实验测定一对二硫键的连接方式为Cys~(36)-Cys~(55)。根据理论和实测分子量的差异推算每个亚基上存在1-2个N-糖基化修饰。 (2) OfHexl的等电点为4.7。 (3)通过肽指纹图谱结合串联质谱确定了OfHexl部分氨基酸序列,证实该酶是由OfHEXl编码的。 (四)亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的酶学性质表征 (1) OfHexl的最适pH为7,最适温度为30℃。 (2) OfHexl的最适底物为天然底物几丁二糖((GlcNAc)_2),其k_(cat)/K_m值为3069s~(-1)mM~(-1)。该酶水解(GlcNAc)_2的效率为已知β-N-乙酰己糖胺酶中最高,但是不能水解N-糖链底物GnGn-PA。OfHexl对于糖苷配基具有选择性,水解速率比MU-β-GlcNAc/MU-β-GalNAc为1.53,MU-β-GlcNAc/MU-β-GlcNAc-6-SO_4~-为156.7。OfHexl的水解产物为β-构型且不能水解不含乙酰氨基的底物MU-β-Glc,说明该酶遵循底物辅助保留机理(substrate-assisted retaining mechanism)。OfHexl水解几丁寡糖((GlcNAc)_n)的速率随(GlcNAc)_n聚合度的升高而显著降低,说明该酶是典型的外切糖基水解酶。OfHexl水解pNP-β-(GlcNAc)_3的初始产物为GlcNAc,说明该酶是从糖链的非还原端开始作用的。 (4)与植物和人β-N-乙酰己糖胺酶相比,OfHexl对底物浓度的变化更敏感。经验证,天然底物(GlcNAc)_2对其的抑制遵循双底物结合机理,其底物抑制常数K_(is)值为69μM。OfHexl不仅能被糖基水解酶20家族抑制剂2-ADN抑制,而且也能被糖基水解酶18家族抑制剂allosamidin抑制,K_i值分别为3.5μM和3.2μM。证实allosamidin能够选择性抑制OfHexl,而对高等动植物β-N-乙酰己糖胺酶基本无效。 综上,本研究获得了编码亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因序列以及天然形式的酶。从该酶编码基因特征,转录水平和底物谱可以判断该酶是专一性参与昆虫几丁质降解的β-N-乙酰己糖胺酶。同时,该酶的组成方式、特殊的底物谱以及allosamidin独特的抑制谱也扩展了对β-N-乙酰己糖胺酶的认识。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S433

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