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《大连理工大学》 2010年
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大气压冷等离子体对Klebsiella pneumoniae灭菌机制和诱变研究

董晓宇  
【摘要】: 近年来,大气压冷等离子体(cold plasma at atmospheric pressure)被广泛地应用于微生物的灭活,国内外学者对等离子体灭活的效率和放电条件进行了不同程度的研究。但是,等离子体对微生物的灭活机制以及它所引起的微生物细胞的积极效应几乎未见报道。克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)被广泛地应用于生产一种重要的化工原料1,3-丙二醇(1,3-propanediol)。由于1,3-丙二醇具有独特的对称结构,因此可以作为单体来生产聚酯、聚醚、聚氨酯等聚合物,市场空间巨大。微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有条件温和、操作简单、副产物少、绿色环保等优点,日益受到国内外学者的青睐。目前,微生物法生产1,3-丙二醇过程中,由于底物和产物抑制微生物生长,因而造成产量过低,生产强度不高的问题。在本论文的研究中,考察了大气压空气介质阻挡放电等离子体所产生的物理和化学因子,并研究了等离子体对生物大分子,蛋白质、多糖和核酸的影响,这不但可以解释大气压冷等离子体灭活的机制,也为等离子体在工业微生物诱变中的广泛应用奠定基础。同时,将大气压空气介质阻挡放电等离子体应用于产1,3-丙二醇菌种克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)诱导和诱变中,以期提高1,3-丙二醇浓度和生产强度。 首先,考察在放电峰值电压为13.0 kV,放电频率为7.0 kHz,放电间隙为3mm的条件下,大气压空气介质阻挡放电等离子体在放电过程中产生的物理化学因子。确定了在此条件下,等离子体可以产生UV (ultraviolet radiation)和ROS (reactive oxygen species),并且菌体内的ROS浓度也出现先升高再降低的波动。 其次,研究了大气压冷等离子体对微生物的灭活机制。实验结果表明,大气压氦气介质阻挡放电等离子体可以导致克雷伯氏菌细胞壁和膜上蛋白质和多糖的氧化分解,从而形成氨基酸、多肽、麦芽糖、葡萄糖和乙酸等。大气压空气介质阻挡放电等离子体可以断裂超螺旋DNA为开环和线性DNA,破坏了DNA的有序性,氢键损伤率随处理时间的延长而增加,导致DNA熔点降低。质粒DNA转化率随处理时间的增加而降低,突变率先增加后减少。碱基鸟嘌呤经大气压空气介质阻挡放电等离子体处理前后的红外光谱图显示,鸟嘌呤分子中的N-H键和C=O键峰高随等离子体处理时间延长而减少,而C-H键的峰高随等离子体处理时间延长而增加,并且在处理样品中出现了新的O-H峰。 再次,大气压空气介质阻挡放电等离子体预处理Klebsiella pneumoniae CGMCC2028种子。结果表明,等离子体处理4min的种子在6%甘油发酵中1,3-丙二醇产量最高,达到16.95 g/L,其甘油脱氢酶达到0.16 U/mg,甘油脱水酶达到10.8 U/mg,1,3-丙 二醇氧化还原酶达到0.61 U/mg。等离子体诱导4 min的种子在6%甘油浓度间歇发酵中,最终1,3-PD产量达到23.8 g/L,生产强度达到1.19g/(L·h),均比对照提高59%。而转化率为0.53 mol/mol,几乎与对照(0.52 mol/m01)相同。在4%甘油浓度批式流加发酵中,诱导种子发酵最终1,3-丙二醇浓度达到46.8g/L,1,3-丙二醇生产强度达到1.5 g/(L·h),甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为0.49 mol/mol,其生产强度比对照(1.08g/(L·h))提高40%。 最后,大气压空气介质阻挡放电等离子体诱变菌株Klebsiella pneumoniae CGMCC2028。等离子体诱变的最适条件为:放电间隙是3mm;输出功率是47.5 W;诱变时间是120 s。在此条件下,克雷伯氏菌在等离子体辐射下,可获得最大的正突变率。诱变后菌液经高浓度甘油和1,3-丙二醇作为底物进行筛选,得到一株稳定高产的诱变菌株Kp-M2。其间歇发酵中,1,3-丙二醇终浓度为19.9g/L,转化率为0.63 mol/mol,生产强度为2.84g/(L·h),比野生菌株分别提高23%、26%和58%。在间歇发酵对数生长期,诱变菌甘油脱氢酶、甘油脱水酶和1,3-PD氧化还原酶的比活性分别为0.65、14.4和1.61U/mg,比野生菌分别提高6倍、0.57倍和11倍。通过对野生菌和诱变菌代谢流分析表明,在诱变菌中各个支路的代谢流重新分布,甘油更多地流向了还原途径。在批式流加发酵中,1,3-丙二醇终浓度为76.7 g/L,生产强度为2.13 g/(L·h),转化率为0.58 mol/mol,比野生菌株分别提高56%、55%和35%。 对诱变菌Kp-M2利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的间歇发酵动力学进行了研究,结果表明,所建立的间歇发酵动力学模型能较好地反映1,3-丙二醇间歇发酵过程。利用响应面法确定诱变菌株Kp-M2间歇发酵生产1,3-丙二醇的最适条件为:初始甘油浓度57g/L、初始pH 7.3、接种时间10 h、培养温度37℃、转速150 rpm。在此条件下进行间歇发酵,获得目标产物浓度29.5 g/L,生产强度为2.11g/(L·h),转化率为0.65 mol/mol。在此条件下进行批式流加发酵,获得目标产物浓度92.0 g/L,生产强度为2.56g/(L·h),转化率为0.56 mol/mol。
【学位授予单位】:大连理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ920.1

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