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泽泻、白芍萜类成分和新型大环内酰胺类化合物抗炎活性及分子机制研究

毕晓旭  
【摘要】:炎症是机体应对外界刺激做出的复杂防御反应,适度的炎症反应对机体是有利的,而过度持久的炎症反应会释放大量的炎症因子,直接或间接造成细胞和组织受损,诱发各种炎性相关疾病发生。目前,从天然资源中获得新型抗炎药物是开发抗炎药物的重要途径之一。本实验室在前期“当归芍药散”药效物质挖掘工作中分别从泽泻和白芍中获得了具有抗炎活性的泽泻三萜成分和白芍单萜类化合物;同时在从动物放线菌中寻找活性物质过程中获得了一类抗炎活性的新型大环内酰胺化合物。为了深入探究泽泻三萜、白芍单萜和大环内酰胺类化合物的抗炎活性及机制,本论文分别以LPS/D-gal诱导小鼠和LPS诱导RAW 264.7细胞建立了体内外炎症模型,采用共聚焦显微成像、RT-qPCR、ELISA和Western blot等多种实验技术手段,从炎症因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达以及炎症信号通路MAPK、NF-κB、JAK/STAT和PI3K/Akt的活化来探讨各单体化合物的抗炎活性及其作用机制。为阐明当归芍药散发挥疗效的分子机制,及新型抗炎药物研发提供了实验依据。主要研究包括以下三部分:一、利用LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型和LPS/D-gal诱导急性肝炎小鼠模型,首次评价泽泻三萜alisol F和25-anhydroalisol F抗炎活性及机制。结果表明 alisol F 和 25-anhydroalisol F 抑制 LPS 激活的 RAW 264.7 细胞释放 NO、TNF-α、IL-1β和IL-6,且在3.3-100 μM浓度范围内均无细胞毒性;另外,alisol F 和 25-anhydroalisol 不仅明显抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和 COX-2 基因水平表达,还显著下调iNOS和COX-2蛋白的表达。Western blot结果表明,alisol F 和 25-anhydroalisol F 降低磷酸化 MAPKs(p-ERK、p-JNK 和 p-p38)和 p-stat3 蛋白表达;同时,显著抑制LPS引起的p-p65和p-IκB-α蛋白的表达,缓解IκB-α蛋白降解,从而抑制LPS引起的p65蛋白在细胞核中的表达,使得p65在胞浆中的表达增多。免疫荧光结果也表明,alisolF和25-anhydroalisolF能够阻碍LPS引起的p65核移位。与体外结果一致,alisolF显著抑制LPS/D-gal诱导的急性肝炎模型小鼠释放TNF-α、IL-1β和IL-6,抑制肝炎小鼠血清中ALT和AST的酶活性。另外alisol F可抑制p-ERK和p-JNK蛋白的表达,缓解IκB-α蛋白的降解,HE染色结果表明alisol F可明显缓解炎症反应引起的肝损伤。推测alisol F和25-anhydroalisol F可能通过阻断MAPK、JAK/STAT和NF-κB信号通路的激活,降低各炎症介质的表达,从而起到抗炎作用。二、利用LPS诱导RAW 264.7细胞建立体外炎症模型,首次考察九个白芍单萜的抗炎活性、构效关系及抗炎机制。结果表明九个单萜类化合物:paeonidanin(PD)、albiflorin(AF)、paeoniforin(PF)、4-O-methylpaeoniflorin(MPF)、benzoylalb-iflorin(BAF)、galloylalbiflorin(GAF)、debenzoylalbiflorin(DAF)、4-O-methylbe-nzoylpaeoniflorin(MBPF)和 paeonidanin A(PDA)可不同程度抑制 LPS 激活的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6,由构效关系分析可知,白芍单萜抗炎活性与化合物的母核结构直接相关,具有paeoniflorin(PF、MPF和MBPF)和paeonidanins(PD和PDA)母核的单碎化合物的抗炎作用明显强于albiflorin类衍生物(AF、BAF、GAF和DAF);另外,在albiflorin单萜母核中引入没食子酰基明显增强其抗炎活性。因此,本研究选择活性较好且量较多的MBPF探讨该类单萜的抗炎机制。结果表明MBPF可显著抑制LPS激活的RAW 264.7细胞iNOS基因和蛋白水平的表达;同时,MBPF明显抑制p-ERK、p-JNK、p-p38、p-c-Jun、p-Akt、p-p65、p-IκB-α蛋白表达,阻止蛋白IκB-α降解,增加p65在胞浆中的表达,而降低p65在核中的表达。因此,推测MBPF可能通过阻断炎症信号通路MAPK、PI3K/Akt和NF-κB激活,而抑制炎症因子表达。三、本研究利用LPS诱导RAW 264.7细胞建立体外炎症模型,首次考察五个大环内酰胺类新型化合物抗炎活性及机制。结果表明五个大环内酰胺类化合物均能抑制LPS激活的细胞释放NO,且无细胞毒性,排除抗炎活性由细胞毒作用引起。五个大环内酰胺类化合物均能够显著抑制LPS激活的巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。选取活性较好且量较多的化合物497-1探讨其作用机制,结果表明497-1不仅抑制iNOS和COX-2基因和蛋白水平的表达,还下调LPS引起的p-p65和p-IκB-α蛋白表达,阻碍IκB-α降解,阻止p65核移位,从而抑制NF-κB信号通路激活;此外,磷酸化MAPKs(p-ERK、p-JNK和p-38)和p-Akt蛋白表达明显受到抑制。由此,推测497-1通过阻断MAPK、PI3K/Akt和NF-κκB信号通路抑制炎症因子表达。


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