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《大连海事大学》 2019年
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海水养殖致病菌核酸微流控实时现场检测关键技术研究

刘士林  
【摘要】:我国水产养殖业发展迅速,成为世界第一水产养殖产量大国。在高密度、集约化的养殖条件下,各种病害也随之频繁发生并广泛传播,成为困扰水产养殖业的主要因素。迟缓爱德华菌(E.tarda)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和灿烂弧菌(V.Splendidus)是我国北方海水养殖常见的致病菌,已给全球水产养殖业带来巨大的经济损失。建立快速、准确的检测技术,实现致病菌的早期诊断和基层的即时检测,对于病害监控和有效预防具有重要意义。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术利用高活性链置换DNA聚合酶在恒温条件(60-65℃)下反应30-60分钟即可完成扩增,其对模板纯度和温控装置要求较低,具有简便、快速、灵敏、特异、低成本等优点,已广泛应用于病原体现场快速检测。微流控技术(microfluidics)是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的科学技术,又被称为芯片实验室(lab-on-a-chip),它为解决致病菌检测的便携化、低成本、自动化等主要问题提供了可能的解决方案。针对致病菌实时现场检测的关键问题,本课题以核酸分析微流控芯片及配套的芯片仪器设备为平台,以E.tarda、V.harveyi和V.Splendidus三种细菌为检测对象,进行致病菌核酸提取、LAMP检测体系构建及多样品、多指标快速检测研究,主要研究工作及相关结果如下:(1)提出了基于旋转三维磁场和水平移动磁场微流控技术的核酸提取方法,研制了多通道/多液池核酸提取芯片及配套的芯片控制装置,进行了功能验证及初步性能考察;(2)进行了灿烂弧菌LAMP引物的设计、筛选和检测体系优化,以及基于微流控芯片的灿烂弧菌LAMP检测基本性能测试,初步构建了灿烂弧菌芯片LAMP检测方法;(3)考察了微流控芯片LAMP系统用于迟缓爱德华菌和哈维氏弧菌检测的基本性能,包括特异性、灵敏度和重复性,构建了芯片LAMP多样品、多指标检测体系。本工作提出的芯片核酸提取过程可自动化完成,快速、高效、易集成;芯片LAMP检测操作简便、可靠(引物可预先固定,实验操作只需加入样品和试剂一步;芯片采用特制的外壳密封,可有效避免污染),仪器价格低、便携性好(尺寸353 mm × 340 mm× 178 mm,重量约7kg),适合现场应用和推广。本研究将为海水养殖致病菌的现场快速检测及相关病害的有效防控提供有效的技术支持。
【学位授予单位】:大连海事大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S941.4

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