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《大连工业大学》 2009年
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人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因表达的研究

李娜  
【摘要】:本文主要研究人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的真核亚克隆及在巴斯德毕赤酵母菌中的表达。 将含有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的宿主菌大肠杆菌BL21经37℃,150rpm的条件下培养,用LB、TB培养基进行培养比较,选择最佳培养基,培养至对数生长期,加入IPTG至终浓度1mM进行诱导。提取的菌体采用超声波、酶溶和化学渗透的方法进行破壁、分离后得到表达产物,并对该表达产物进行酶活性检测和SDS-PAGE分析。 人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因进行真核表达的研究。将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoR I/Not Ⅰ酶切位点中,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,涂布LB平板过夜培养菌体。从平板上挑选单菌落提取质粒DNA后,使用EcoR I/Not Ⅰ进行双酶切鉴定。将酶切鉴定结果正确的质粒用Sac Ⅰ酶切使之线性化,然后使用乙醇精制回收目的片段,电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,涂布MD平板培养。挑选菌落,使用Takara LA Taq进行PCR筛菌。 筛出的菌落在28℃,150rpm的条件下培养,用BMGY培养基进行生长阶段的培养,然后换BMMY培养基进行诱导阶段的培养,此阶段加入甲醇作为诱导剂进行该基因的诱导表达,并对进行培养条件的优化实验和空白对照实验。 研究结果表明,人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因在大肠杆菌中表达出的酶蛋白没有活性,而在巴斯德毕赤酵母表达出的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,且培养的最佳提取时间为96h、甲醇浓度为0.5%,在此基础上,经SDS-PAGE分析,确定其分子量为52kDa,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。
【学位授予单位】:大连工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q786

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