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《大连工业大学》 2016年
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海参溶菌酶在酿酒酵母表达系统的构建及分析

随瑞瑞  
【摘要】:研究发现,海参i-型溶菌酶具有糖苷酶活性以及广谱、非酶抑菌活性。海参溶菌酶通过水解细胞壁上N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺间的β-1,4糖苷键裂解细菌细胞,可以有效地抑制水产养殖以及食品加工过程中的有害细菌。本实验采用酿酒酵母MKP-0表达海参溶菌酶蛋白(Stichopus japonicus lysozyme,Sj Lys)。以实验室保存的克隆质粒p MD18-Sj Lys为模板,将His-tag标签克隆到海参溶菌酶基因的N末端,构建克隆载体p MD18-His6-Sj Lys。根据密码子偏好性分析,依次对Sj Lys蛋白的第69、77和95位精氨酸密码子通过定点突变进行优化,构建克隆载体p MD18-His6-Sj Lys((35)69,77,95)。通过Spe I/Bgl II双酶切,将His6-Sj Lys与His6-Sj Lys((35)69,77,95)目的片段分别连到酿酒酵母表达载体p ESC-LEU上,构建重组胞内表达载体p ESC-LEU-His6-Sj Lys和p ESC-LEU-His6-Sj Lys((35)69,77,95)。醋酸锂法将质粒分别转化至酿酒酵母MKP-0细胞。p ESC-LEU-His6-Sj Lys((35)69,77,95)/MKP-0通过2%半乳糖诱导60 h后,western blot检测成功表达Sj Lys目的蛋白。对半乳糖诱导时间进行梯度检测,结果发现诱导72 h后Sj Lys蛋白表达量最高。溶壁微球菌的牛津杯法抑菌实验和扫描电子显微镜观察的结果表明,酿酒酵母MKP-0细胞能成功表达具有抑菌活性的Sj Lys蛋白。但是,Sj Lys蛋白在酿酒酵母胞内的表达量比较低,所以又进行了酿酒酵母胞外分泌表达Sj Lys蛋白的研究。以实验室保存的含有MFα1信号肽的毕赤酵母表达载体p PIC9K为模板,PCR扩增MFα1片段并连接到p MD18-T上,得到克隆质粒p MD18-T-MFα1。经Not I/Spe I双酶切,将MFα1片段连接到p ESC-LEU-His6-Sj Lys((35)69,77,95)上。重组胞外分泌表达载体p ESC-LEU-MFα1-His6-Sj Lys((35)69,77,95)转化至酿酒酵母MKP-0中,构建海参溶菌酶胞外分泌表达系统。本实验首次在酿酒酵母中表达了具有活性的Sj Lys蛋白,为Sj Lys的生产提供了一种具有可行性的新方法。
【学位授予单位】:大连工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78

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