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《大连工业大学》 2016年
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VIGS技术在解析喜树代谢途径中的应用

闫通帅  
【摘要】:喜树(Camptotheca acuminate Decne)是中国传统珍贵的药用植物,是高效抗肿瘤药物喜树碱的主要来源。喜树碱属于单萜吲哚生物碱,是喜树主要的生理活性物质。但与绝大多数药用植物中次生代谢物的积累量相类似,喜树中天然喜树碱含量却很低,无法满足市场需求。而通过次生代谢调控手段提高喜树碱产量的前提是喜树碱生物合成代谢途径的阐明。为了实现对喜树碱合成途径相关酶基因的克隆和功能鉴定,完成代谢途径的解析,找到一种快速、有效的基因筛选鉴定方法便显得尤为重要。病毒诱导的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后,可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化,进而根据表型的变异,研究目标基因的功能。VIGS是根据植物对RNA病毒防御机制发展起来的一种技术,其内在的分子基础是转录后基因沉默(Post-transcript Gene Silence)。与传统的基因功能分析方法相比,VIGS能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析,可以避免植物转化,克服功能重复,可以在不同遗传背景下起作用,对基因功能分析更透彻。因此,VIGS一经建立,即被视为研究植物基因功能的强有力工具,得到了深入的研究和广泛应用,已用于烟草、番茄等植物的抗病反应、生长发育以及代谢调控的功能基因研究。本论文以喜树为研究对象,重点采用VIGS技术结合共表达分析,筛选鉴定喜树碱代谢途径中的关键酶基因CaG10H、CaHGO、CaTDC1和CaSTR,进而初步解析出喜树碱代谢途径。设计特异性引物,克隆CaG10H、CaHGO、CaTDC1和CaSTR等基因,构建TRV-VIGS载体基因,TRV-VIGS载体转化农杆菌GV3101后侵染喜树幼苗叶片,3-4周后,提取喜树叶片RNA及喜树碱,再利用qRT-PCR和HPLC技术分别检测其基因表达量和代谢谱。与对照组比对结果表明,实验组四个基因的基因表达量下降了60%-85%,叶片喜树碱(CPT)及10-羟基喜树碱(10-HCPT)积累量下降了35%及30%左右;最终确定VIGS技术在喜树代谢途径酶基因功能鉴定上应用成功。因此VIGS技术可用于解析喜树的代谢途径,进一步通过共表达分析筛选功能细胞色素P450家族基因,确定其在代谢途径中的具体位置及功能,研究结果为喜树代谢途径的解析及其他一些基因功能的鉴定奠定了基础。
【学位授予单位】:大连工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S567.19;Q943.2

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