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《大连工业大学》 2016年
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环果寡糖糖基转移酶基因的异源表达及催化机理研究

孙晓萌  
【摘要】:环果寡糖(Cyclofructans,CFs)是一种环型寡糖,在其分子中心处有一个特有的冠醚核心骨架。CFs通常由环果寡糖糖基转移酶(Cycloinulooligosaccharide fructanotransferase,CFTase)催化菊糖分子内转糖基反应而产生。另外,CFTase还可以通过歧化或者偶合反应催化β-(2-1)-果寡糖分子间的转果糖基反应。本论文以菊糖降解菌Paenibacillus sp.Lfos16为研究对象,根据已知果糖苷酶基因序列的保守性设计多对引物,通过PCR方法从Paenibacillus sp.Lfos16基因组DNA中克隆到一个DNA片段,然后通过TAIL PCR和SEFA PCR获得CFTase基因(cft)侧翼序列。最终获得的cft ORF全长4017 bp,编码1339个氨基酸,预测蛋白分子量为150 kDa,其中N端前31个氨基酸为分泌信号肽。将Lfos16的cft插入表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pCFT150,在大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主菌进行诱导表达。异源表达CFTase粗酶酶活为73.80 U/L,比野生菌CFTase酶活提高了1.2倍。同时对Lfos16的cft序列进行分析和比对,将其分为6个区段:N端的信号肽区,N端和C端的3个重复序列区(R1,R3和R4),以及内切酶同源区(ERH)和核心区(CR)。通过构建不同重组质粒比较原始酶蛋白(CFT150)与四种截短突变体蛋白(CFT140:去掉信号肽;CFT122:去掉R4;CFT106:去掉R1和R4;CFT87:去掉R1,R3和R4)的差异推测了每个区段的功能。其中CFT140,CFT106与CFT150活性类似,都具有菊糖环化活性以及CF的水解活性;而CFT122和CFT87则失去这两种活性。因此通过实验结果可以推测Lfos16 cft的C端R4区为环化功能和CF水解功能区。而ERH区和CR区则可能与歧化及菊糖水解有关。
【学位授予单位】:大连工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78;O629.8

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