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《沈阳农业大学》 2011年
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灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性机制研究

刘大伟  
【摘要】:大豆胞囊线虫病(Soybean Cyst Nematode, SCN)是大豆生产中的重要病害之一。从世界范围来看,大豆胞囊线虫病的为害和蔓延日趋加重。本论文系统地从防御酶系的活性、次生代谢物质的含量、膜脂过氧化作用、光合作用、物质代谢等角度研究了我国特有的抗病品种灰皮支黑豆(ZDD2315)抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生理生化机制;并首次利用抗病品种灰皮支黑豆与辽宁省的主栽品种辽豆15配制杂交组合,通过分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA)建立了F4代抗、感池,采用双向电泳技术和质谱分析技术,寻找与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的差异蛋白;同时利用新一代高通量测序技术,筛选抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15在大豆胞囊线虫3号生理小种侵染前后差异表达的基因,揭示灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的分子机制。主要研究结果如下: 1.明确了抗病品种灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性不具有抗侵入的作用,而具有抗发育的作用。利用冰冻切片技术研究抗、感品种灰皮支黑豆和辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后根部的组织病理学反应,明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的组织结构抗性。 2.明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生化机制。抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后,根内多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶的活性均表现升高,并且在灰皮支黑豆中各种防御酶系的活性高峰出现的较早,根内的总酚、类黄酮含量也都表现增加,但在灰皮支黑豆中的含量后达到峰值。 3.明确了灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生理机制。抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后,辽豆15的细胞膜受到了严重的伤害,根内丙二醛(MDA)的含量显著增加,电解质大量外渗,根内可溶性糖的含量与对照相比显著增加,可溶性蛋白的含量也明显增加,叶片的叶绿素含量明显降低;而灰皮支黑豆的细胞膜受损程度较轻,根内丙二醛(MDA)的含量虽有少量增加但与对照相比差异不大,电解质少量外渗,根内可溶性糖的含量低于辽豆15,可溶性蛋白的含量却高于辽豆15,叶片的叶绿素含量无明显变化。 4.利用BSA法成功构建了灰皮支黑豆((?))和辽豆15((?))杂交后代F4抗、感池材料,通过双向电泳获得了抗、感池的2-DE图谱,在凝胶上各检测到近400个蛋白点,对差异表达的27个蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定,获得了这27个蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF),通过Mascot数据库搜索比对,共鉴定出了16个蛋白点,其中仅在抗病池特异表达的蛋白点有hypothetical protein SORBIDRAFT_04g012541 (Spot No.7), predicted protein (Spot No.195), ATPase alpha subunit (Spot No.224), homeobox-like protein (Spot No.243);仅在感病池特异表达的蛋白点有unknown (Spot No.14);抗病池中表达量上调2倍以上的蛋白点有unknown (Spot No.53,71,284), hypothetical protein SORBIDRAFT_04g012541 (Spot No.116), trypsin inhibitor p20 (Spot No.117), Xylem serine proteinase 1 precursor, putative (Spot No.118), triosephosphate isomerase (Spot No.173,187), caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase 2 (Spot No.204);抗病池中表达量下调2倍以上的蛋白点有putative RNA polymerase III (Spot No.296), ATP synthase beta chain (Spot No.340). 5.利用RT-PCR技术分别获得了灰皮支黑豆573bp的胰蛋白酶抑制剂基因的序列和848bp的咖啡酰辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)基因的序列,同时利用实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)明确了抗病品种灰皮支黑豆和感病品种辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后根内胰蛋白酶抑制剂基因的变化规律:大豆胞囊线虫侵染后,胰蛋白酶抑制剂基因在灰皮支黑豆根内的相对表达量始终高于辽豆15,并且在大豆胞囊线虫侵染后25d时灰皮支黑豆根内的胰蛋白酶抑制剂基因的相对表达量达到最高值。 6.利用新一代高通量测序技术对灰皮支黑豆和辽豆15受大豆胞囊线虫3号生理小种侵染后的基因表达谱进行分析,筛选出受大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫诱导表达的差异基因,灰皮支黑豆受大豆胞囊线虫胁迫诱导上调表达的差异基因有389个,下调表达的差异基因有344个;辽豆15豆受大豆胞囊线虫胁迫诱导上调表达的差异基因有222个,下调表达的差异基因有691个。这些差异表达的基因涉及激素应答、转录因子、蛋白激酶、热激蛋白、防御酶系、PR蛋白等方面。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S435.651

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