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蓝莓多糖的分离纯化、结构鉴定及免疫活性研究

孙希云  
【摘要】:蓝莓(Blueberry),又称越桔或蓝浆果,属杜鹃花科越桔属(Vaccinium)落叶灌木植物,因其具有较高的保健价值而风靡世界,是联合国粮农组织(FAO)推荐的五大健康水果之一。蓝莓中含有酚酸、花青苷及黄酮素等多种活性成分,国内外已有较深入研究。但对于蓝莓中含有的多糖还未见有详细报道,且有资料显示在蓝莓果渣中含有较多的多糖类物质(潘一峰,2005),具有非常大的潜在开发利用价值。本研究以蓝丰品种为原料,对蓝莓多糖进行了提取、纯化及分离鉴定,并对其体内抗肿瘤及免疫调节作用和部分体外活性进行了详细的研究,为今后蓝莓多糖的深入研究与开发利用奠定了理论基础。研究结果如下: (1)分别将水浸法、酶法、超声波法应用于蓝莓多糖的提取,并采用正交分析优化提取工艺,得到三种提取方法的最佳工艺条件。水浸法:料水比为1:60 g/mL,温度为90℃,时间为4 h,蓝莓多糖的得率为2.12%。酶法:酶解时间为100 min,酶解温度为40℃,酶添加量为0.6%,料水比为1:60 g/mL,蓝莓多糖的得率为2.32%。超声波辅助法:提取时间为40 mmin,提取温度为50℃,超声波功率为80W,料水比为1:60g/mL,蓝莓多糖的得率为2.34%。可以看出,超声波提取法成本低,效率高,而且提取量大,是提取蓝莓多糖较好的方法。 (2)比较了Sevag法、三氯乙酸法、酶法与Sevag法结合脱蛋白的效果,结果表明酶法与Sevag法结合脱蛋白效率较高,其最佳处理条件为:木瓜蛋白酶用量为0.15%,pH 6.5,60℃恒温2h,离心得上清液,再用Sevag法脱蛋白4次基本上就可以将蛋白脱除干净,且此法对多糖的保留率较前两者都高,可达78.28%,是脱蛋白的较好方法。 (3)采用双氧水进行脱色,综合考虑脱色率和最终样品的保留率,较好的选择应为:双氧水的添加量为40%,脱色pH为8.5,脱色温度为50℃,脱色时间为4 h,蓝莓多糖的脱色率为93.11%,多糖保留率为79.24%。 (4)脱色脱蛋白后的多糖经过DEAE-52纤维素柱层析,分别用蒸馏水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl洗脱,得到BBP1、BBP2、BBP3和BBP4四个组分,得率分别为11.77%、14.08%、34.65%和10.35%。将BBP3经Sephacryl S-300葡聚糖凝胶层析进一步分离纯化,经0.1 mol/L NaCl洗脱得到两个组分BBP3-1和BBP3-2。将BBP3-1经过紫外吸收光谱、Sephacryl S-300葡聚糖凝胶层析柱和HPLC检测验证其为单一多糖。 (5)理化性质研究表明:蓝莓多糖BBP3-1为白色粉末固体,无特殊气味;易溶于热水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂;在水溶液中比旋光度[α]20D=+17。。鉴定反应表明:该多糖是不含有N元素,不含酚类、不含氨基酸或蛋白质的非淀粉类酸性多糖;BBP3-1重均分子量Mw为18643 Da,数均分子量Mn为9658 Da,峰位分子量Mp为3554 Da,分子量分布宽度(Mw/Mn)为3.186。蓝莓多糖(BBP)粘度特性研究表明:溶液浓度、温度、NaCl浓度、pH、热处理和剪切速率均对其黏度产生一定的影响。 (6)气相色谱分析确定BBP3-1的单糖组成为:鼠李糖、半乳糖和葡萄糖,摩尔比为:1:1.5:2。红外光谱显示BBP3-1具有多糖的特征吸收峰,推测其是含有p-D-吡喃葡萄糖或半乳糖,不含甘露糖,含有糖醛酸的酸性多糖。核磁共振分析,可推测BBP3-1可能是以1,6键连接的吡喃葡萄糖链为主链,含有鼠李糖、半乳糖和葡萄糖的p构型多糖。 (7)建立S180荷瘤小鼠模型,用400 mg/Kg体重.d、200 mg/Kg体重.d、100 mg/Kg体重.d三个剂量的蓝莓多糖溶液灌胃30d。结果表明,蓝莓多糖能显著抑制小鼠肿瘤的生长,且能提高荷瘤小鼠的胸腺指数、脾指数,显著增强荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖化能力,明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力,显著促进荷瘤小鼠细胞因子TNF-a、IFN-γ、IL-2的分泌,明显提升荷瘤小鼠的NK细胞活性,说明蓝莓多糖可以通过免疫调节系统来抑制肿瘤细胞的生长,其中低剂量组100mg/Kg体重.d效果最好;对SRBC引起的小鼠迟发型过敏反应蓝莓多糖高剂量组400 mg/Kg体重.d有极显著的抑制作用。 (8)蓝莓多糖体外给药对正常小鼠免疫功能有显著提升作用。实验表明,蓝莓多糖对脾淋巴细胞的转化能力有显著提升作用,但与ConA之间存在极明显的相互抑制作用;蓝莓多糖对巨噬细胞吞噬中性红的能力也有显著提升作用,且与ConA之间存在极明显的协同增效作用。 (9)蓝莓多糖功能性质研究实验结果:抗氧化实验表明,蓝莓多糖对OH·和DPPH·自由基有较强的清除作用,且清除率随其浓度的增加而提高,但对02-·几乎没有作用效果;对豆油和猪油抗氧化作用表明蓝莓多糖具有一定的抗脂质过氧化作用,但作用不是很明显,与柠檬酸有显著协同增效作用。采用体外对α-淀粉酶的清除作用来评价蓝莓多糖的降血糖作用。试验结果表明,蓝莓多糖对α-淀粉酶的有一定的清除作用。通过对几种常见菌种的抑菌效果试验表明,蓝莓多糖没有明显的的抑菌作用。


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