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《沈阳农业大学》 2011年 博士论文
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苦参内生真菌抑菌物质纯化鉴定及作用机制研究

何璐  
【摘要】:本论文采用16Sr-DNA测序法、响应面分析法、捷克八层析法、1H-NMR、13C-NMR和LC-MS等研究方法,从苦参种子中分离筛选出具有抑菌活性的5种内生真菌,并对BS001菌株的分类地位和发酵条件进行了系统研究。纯化鉴定了BS001菌株的抑菌活性物质,并对其抑菌作用机制进行了深入研究。BS001菌株鉴定为土曲霉(Aspergillu terreus);明确了BS001菌株的最佳液体发酵条件;分离获得一种新型抑菌活性物质;阐明了该抑菌物质对黄瓜枯萎病菌的抑菌机制及对土壤微生物的影响。本研究成果为苦参内生真菌及其抑菌活性物质的有效利用奠定了坚实基础。 本论文测定了分离获得的5种苦参内生真菌对25种植物病原真菌和14种常见细菌的拮抗作用,其中BS001菌株对油菜菌核病菌、苹果斑点落叶病菌、番茄炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、小麦纹枯病菌、辣椒疫霉病菌有抑菌效果,其中对黄瓜枯萎病菌抑菌效果明显,抑菌直径达25mm;对铜绿假单胞菌、苏云金杆菌、白葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、产气肠细菌、普通变形杆菌、姜瘟病菌、地衣芽孢杆菌及白菜软腐病菌有抑菌效果,其中对产气肠细菌有抑菌效果明显,抑菌直径达14mm; 用Placket Burman分析法设计试验,选择影响的主效应因子,用统计学的原理、对试验数据进行极差分析,最后用RSM (Response surface methodology)分析法并借助Design expert 8.0软件分析数据,确定了BS001菌株的最佳发酵条件。确定接种量为107cfu/mL;250 mL锥形瓶装液量为100 mL;转速为150 r/min;培养温度为25℃;代谢因子KH2P04的加入量为1 mmol/mL;培养基初始pH为5;马铃薯加入量为335 g/L;最佳碳源为葡萄糖的其加入量为35g/L;最佳氮源NH4N03的加入量为1.80g/L为最佳发酵条件。 在LC-10AT VP高效液相色谱输液泵(日本岛津公司),SPD-10A VP紫外检测器(日本岛津公司),分析色谱柱:DiamonsilTM-C18 (5μm,250mm×4.6 mm I.D.),流动相:甲醇:2%磷酸=2:8,流速:0.5mL/min,检测波长:220nm,进样量:10μL的分析条件下,对BS001菌株发酵液成分进行分析。确定了内生真菌BS001的次生代谢产物中存在与药用植物苦参相同的成分——氧化苦参碱和苦参碱,测定二者的保留时间分别为:9.282 min和13.298 min。 利用大孔树脂HPD-100吸附,乙酸乙酯萃取,10-20%乙醇梯度洗脱,得到了BS001菌株发酵液中对黄瓜枯萎菌具有抑制作用的抑菌物质结构,确定其为:(2E,2E')-((Z)-2,3-dihydroxy-5,8-dioxocyclooct-6-ene-1,4-diyl)dibut2-enoate,为一新化合物。初步命名为千山霉素。 初步明确了新抗菌活性成分对黄瓜枯萎菌的作用机理。确定抑菌物质对黄瓜枯萎病菌丝生长起抑制作用,同时抑制孢子萌发。并且可以使细胞膜结构受损,但不能产生几丁质酶水解几丁质或者破坏几丁质的合成。千山霉素对蛋白质合成没有显著影响,但对合成羧甲基纤维素酶有抑制作用。 调查了千山霉素对室内黄瓜小苗的生物防治效果。从室内试验结果看,千山霉素160μg/mL及320μg/mL溶液15d调查的防效分别为80.10%和81.82%,与对照液30%噁霉灵水剂40μg/mL溶液的防效84.83%效果相当。在F=0.01水平上,千山霉素160μg/mL溶液15d调查的防效效果显著,考虑经济成本,认为千山霉素160μg/mL为最佳试验浓度。 千山霉素对土壤中的细菌,放线菌及真菌都有一定影响,能够增加细菌数量,同时可以减少真菌的数量。可见千山霉素能够增加有益菌群,减少有害菌群,从而达到预防黄瓜枯萎病的目的。


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