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《沈阳农业大学》 2017年
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黄瓜CsTCTP蛋白表达调控相关信号途径分析及酵母双杂交体系构建

陈秋敏  
【摘要】:黄瓜白粉病[Sphaerotheca fuliginea(Schlecht)Poll.]是一种广泛发生的叶部病害,常造成极大的经济损失。目前除应用化学法防治白粉病外,主要依靠选育抗性品种,但长期种植,植株抗性水平逐渐下降。因此,深入研究黄瓜-白粉病互作的分子机制并寻找新的抗性基因资源具有重要意义。本实验室前期研究表明,翻译控制肿瘤蛋白CsTCTP1在黄瓜响应白粉病菌侵染过程中起到重要的调节作用,且CsTCTP1的表达受到外源物质ABA、乙烯、雷帕霉素(TOR抑制剂)等的调控,但CsTCTP1在黄瓜响应白粉病侵染过程中是如何执行其生物学功能的尚不清楚。基于此,本试验利用生物信息学方法,分析预测了 CsTCTP的结构与功能;应用实时荧光定量PCR技术,检测了 TOR、ABA和乙烯信号途径的关键基因在白粉病菌胁迫下的表达变化,初步分析黄瓜CsTCTP1与这些信号通路的相关性;同时,成功构建了CsTCTP1和CsTCTP 的酵母双杂交诱饵表达载体和过表达载体,为深入研究黄瓜CsTCTP蛋白在应答白粉病菌胁迫中的作用与机制奠定基础。本研究主要结果如下:(1)对黄瓜TCTP进行了生物信息学分析。黄瓜有2个TCTP,分别为CsTCTP1和CsTCTP2,CDS区长度均为504bp,且编码168个氨基酸,具有2个TCTP特征结构区(TCTP-1和TCTP-2)。黄瓜TCTP亚细胞定位于细胞质上,为亲水性蛋白,且表现为酸性,α螺旋为TCTP蛋白二级结构中的主要结构。蛋白功能初步预测黄瓜TCTP在翻译、氨基酸的生物合成、能量代谢和胁迫响应等方面发挥主要作用。对不同植物TCTP构建进化树,结果显示黄瓜CsTCTP1与甜瓜的TCTP亲缘关系最近,不同植物TCTP的氨基酸序列一致性高达85.96%,且都具有相同的已知保守结构域。(2)应用实时荧光定量PCR技术,初步研究了黄瓜在白粉病菌胁迫下,黄瓜TOR信号通路相关基因TOR、SnRK1,ABA信号通路关键基因PP2C、SnRK2.1、ABI5和乙烯信号通路基因CTR1、EIN2的表达变化情况。结果表明,这些基因受黄瓜白粉病菌诱导表达,且与CsTCTP1在白粉病菌胁迫下的表达模式相一致。推测黄瓜CsTCTP1响应白粉病菌胁迫可能与ABA、TOR、乙烯等信号通路相关。(3)构建CsTCTP1和CsTCTP2的诱饵表达载体,转化酵母细胞,并验证细胞毒性及自激活活性。通过PCR扩增得到CsTCTP1和CsTCTP2完整的CDS区,并将其重组到诱饵表达载体PGBKT7上,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-CsTCTP1和pGBKT7-CsTCTP2,并将诱饵表达载体转化到酵母细胞Y2HGold中。经验证,诱饵表达载体的融合蛋白对酵母细胞没有细胞毒性,且不具有自激活作用,可用于后续进一步研究,为深入研究黄瓜TCTP的作用机制奠定基础。(4)成功构建了 CsTCTP1和CsTCTP2的过表达载体。通过Gateway技术,将CsTCTPs的编码区构建到过表达载体pB7FWG2中,测序结果显示与已知序列完全一致,说明过表达载体构建成功,可用于下一步研究,且该过表达载体含有GFP标签,可为后续黄瓜TCTP精细定位、瞬时及稳定转化提供实验材料。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S436.421;Q943.2

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