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《沈阳农业大学》 2017年
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蓖麻蚕和柞蚕烯醇化酶基因与草地螟线粒体基因组

马红方  
【摘要】:烯醇化酶是一种多功能蛋白,在生理病理中有重要作用。目前,对烯醇化酶的了解主要来源于人和病原微生物方面的研究工作,而来自昆虫方面的研究工作极少。我们实验室最先开展了昆虫烯醇化酶的鉴定工作。从柞蚕中分离出2个烯醇化酶基因,分别命名为烯醇化酶Ⅰ和烯醇化酶Ⅱ,并发现烯醇化酶Ⅱ很可能是鳞翅目昆虫特异的,且仅在生殖腺中表达,而烯醇化酶Ⅰ则广泛存在于各种昆虫中。为了探讨烯醇化酶的起源进化,仍需要在更多物种中调查烯醇化酶Ⅱ的序列特征和组织表达特征,同时需要对烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ的酶学特性进行鉴定和比较。本论文中,我们以蓖麻蚕为研究材料,比较了烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ的序列特征、发育表达特征;以柞蚕为研究材料,利用qRT-PCR技术进一步调查了烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ的组织表达特征,进行了原核表达和抗体制备。昆虫线粒体基因组测序可以为了解线粒体基因组结构、构建物种系统发育关系等提供基础数据。本论文中,我们对鳞翅目重要害虫之一的草地螟线粒体基因组做了生物信息学分析,并利用线粒体基因组全序列重建了 24种螟蛾总科(来源于2个家族10个亚家族)昆虫的系统进化关系。本论文取得的研究结果如下:1.蓖麻蚕烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ分别编码433和431个氨基酸。蓖麻蚕烯醇化酶Ⅰ与Ⅱ的序列一致性仅为60%,而蓖麻蚕烯醇化酶Ⅰ与已经鉴定的鳞翅目昆虫烯醇化酶Ⅰ在蛋白水平上的序列一致性为91%~97%,蓖麻蚕烯醇化酶Ⅱ与已经鉴定的鳞翅目烯醇化酶Ⅱ的序列一致性为84%~92%。进化分析表明,昆虫烯醇化酶Ⅱ和Ⅰ是独立进化的。qRT-PCR检测结果表明,在胚胎期,烯醇化酶Ⅱ属于痕量表达,而烯醇化酶Ⅰ的表达水平很高;蛹期精巢中烯醇化酶Ⅰ的表达量较低,而烯醇化酶Ⅱ的表达量远高于Ⅰ。这一结果说明烯醇化酶Ⅱ与生殖发育有关。2.在柞蚕胚胎发育期和幼虫期,烯醇化酶Ⅰ的表达量均高于烯醇化酶Ⅱ;在蛹期,烯醇化酶Ⅰ的表达量也微高于烯醇化酶Ⅱ。同时,我们成功构建了重组表达质粒pET28b(+)-ApenoⅠ和Ⅱ,并获得了以可溶性或包涵体形式表达的重组蛋白rApenoⅠ和rAenoⅡ。Western blot检测结果表明,rApeno Ⅰ和rApenoⅡ能正确表达。利用重组蛋白经4次免疫家兔后,获得了高滴度的抗体。免疫学试验结果表明,ApenoⅠ和Apeno Ⅱ均在柞蚕的血液、生殖腺及脂肪体中表达,进一步试验发现所制备的两个抗体存在严重的交叉反应。柞蚕烯醇化酶Ⅰ和Ⅱ原核表达的成功为下一步开展酶学特性的研究奠定了基础。3.草地螟线粒体基因组中AT含量及偏好性与螟蛾总科的线粒体基因组基本相似。基因间隔区虽然分布于15个区域,但只有位于tRNAGln ND2之间和tRNASer(UCN)和ND1之间的2个区域的基因序列在螟蛾总科均存在。鉴定了草地螟A+T富集区的3个保守序列。基于线粒体基因组全序列的系统进化分析结果支持螟蛾总科分为螟蛾科和草螟科两个家族;进一步将草螟科分为两个进化枝,PS进化枝和非PS进化枝,PS进化枝包括野螟亚科Pyraustinae和斑野螟亚科Spilomelinae,非PS进化枝包括草螟亚科Crambinae、水螟亚科 Acentropinae、苔螟亚科 Scopariinae、禾螟亚科 Schoenobiinae。这是首次利用线粒体基因组全序列探讨螟蛾总科的系统发育关系。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S433.4;Q966

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