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《沈阳农业大学》 2017年
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岷江百合GPAT基因启动子的克隆与功能元件初步分析

齐伟康  
【摘要】:现今社会,研究环境胁迫对植物生长发育的影响已经成为生物学术界的热门。运用基因技术等手段提高植物的抗逆性已成为方法之一。启动子是调控基因表达的关键。所以克隆和构建环境诱导型启动子是培育植物抗逆品种的根本途径。基于近些年的研究结果,诸如CaMV35S、玉米Ubiquitinpromoter等启动子已经被广泛应用。但是这些启动子的特性决定着它们在植物的整个生长发育时期都会高水平表达,不仅会造成资源浪费,严重时会使植物致死,无法达到高效,可调控(定时、定点、定量)表达。而诱导型启动子可以诱导植物在特定的时期、特定条件下表达,避免了不必要的资源浪费,也降低了给植物造成的有害影响。因此诱导型启动子的探究和应用成为研究者们追逐的新潮。本研究基于前人和课题组研究的结果,选取岷江百合作为试验材料,利用有效的基因克隆技术,克隆岷江百合GPAT基因的启动子,并对该启动子做了初步的表达分析,主要结果如下:1.基于本课题组研究得到的岷江百合GPAT基因序列,在该基因编码区设计基因特异性引物,以岷江百合基因组DNA为模板,运用融合嵌套PCR和接头PCR技术克隆岷江百合GPAT基因启动子,共步移得到1007bp的启动子序列,命名为GPATp。2.对步移得到的1007匕p启动子序列进行序列分析,利用NewPLACE、PlantARE等分析预测网站,结果发现在序列中包含许多的TATA-box、CAAT-box等核心顺式元件,另外还有许多与环境胁迫相关的顺式作用元件和组织特异性元件。3.利用缺失克隆,并以GUS为报告基因对启动子进行表达分析,构建了 5个缺失启动子片段:GPATp1(954bp)、GPATp2(644bp)、GPATp3(386bp)、GPATp4(231 bp)、GPATp5(169 bp),分别将这些启动子片段替换植物表达载体pCAMBIA 3301中的35S启动子,构建了 5个植物重组表达载体,分别命名为GPATp1~5.4.烟草转化:利用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草叶盘,以GUS基因为报告基因进行瞬时表达分析,结果显示:该GPATp5(169 bp)组叶盘没有被染成蓝色,说明该启动子片段不能调控GUS基因表达,启动子没有活性;GPATp4(231 bp)组在其他四组之中的表达最弱,结合启动子预测分析结果推测该片段是最小的具有启动子活性的片段;GPATp3(386bp)组比GPATp4(231 bp)组相对染色较深,但弱于GPATp2(644 bp)组和 GPATp1(954 bp)组;GPATp2(644 bp)组深于 GPATp3(386 bp)组;GPATp1(954 bp)组颜色最深,说明该片段活性最强。在进行缺失重组载体转化烟草的同时,每组转化分别进行常温(25 ℃)和低温处理(4℃),结果发现:GPATp1(954 bp)组和 GPATp2(644 bp)组在 4 ℃处理一段时间之后,相对同组常温叶盘颜色略微加深,但不明显,启动子预测分析显示在该启动子片段中含有冷相关顺式元件,说明该启动子在一定程度上受冷诱导,但具体诱导情况还需进一步研究。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q943.2;S682.29

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