收藏本站
《沈阳农业大学》 2017年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

树舌灵芝FIP在毕赤酵母中的优化表达及与赤灵芝、紫芝FIP的比较

段作文  
【摘要】:真菌免疫调节蛋白(FIP)是近年来从高等真菌中发现的一类结构与免疫球蛋白重链可变区相似的小分子蛋白,具有明显的免疫调节、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等活性,且没有任何毒副作用,具有开发成免疫调节剂和药物的潜力。本论文主要由两部分组成。第一部分为树舌灵芝FIP基因的优化、重组表达和生物学功能的验证。为研究树舌灵芝的活性成分及生物学功能,采用同源克隆的方法从树舌灵芝子实体基因组中克隆出两种树舌灵芝FIPs基因(FIP-gap1和FIP-gap2)。根据毕赤酵母对密码子使用的偏爱性,优化FIP-ga即1/2基因,并在其C端添加组氨酸标签序列,构建重组表达载体pPIC9-His-FIP-gap1/2。利用毕赤酵母GS115高效重组表达FIP-gap1/2。SDS-PAGE 和 Western blot 结果表明,rFIP-gap1/2 大约在 14 KDa 和 17 KDa处有蛋白条带,重组蛋白正确表达。rFIP-gap1/2在第4天的表达量最高,表达量分别达到207.4和157.5 mg/L,远高于未经优化的FIP-gap1和FIP-gap2的表达量(2.66和4.56 mg/L)。rFIP-gap1/2经过HIS TrapTM FF柱层析纯化、透析和冷冻干燥,获得纯化的rFIP-gap1/2,并进行体外生物活性检测。结果表明,rFIP-gap1在浓度为1μg/mL时就能够凝集人、小鼠和羊的血细胞,而rFIP-gap2只有当浓度达到8 μg/mL以上时才能凝集这三种血细胞;rFIP-gap1/2也都可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖,且最佳作用浓度均为4μg/mL;除此之外,rFIP-gap1/2还能够明显地促进细胞因子IL-2和IFN-y的分泌,促进IL-2的表达量分别为622.5和416.5 pg/mL,而促进IFN-y的表达量分别为1381和1624 pg/mL;采用MTT法测定rFIP-gap1/2对A549、Hela和MCF-7三种癌细胞的抑制效果,结果表明,rFIP-gapl对A549、Hela和MCF-7三种细胞抑制效果较好,在浓度为32 μg/mL时,抑制率分别为 53.7%、82.9%和 82.5%,IC50值分别是 29.89%、8.34%和 12.19 μg/mL。同样的浓度下,rFIP-gap2对A549和Hela细胞抑制效果不好,抑制率分别为13.9%和8.7%,IC50值分别为60.92和41.05μg/mL,而对MCF-7细胞的抑制效果较差,没发现抑制作用。经毕赤酵母的高效重组表达,成功的获得具有生物学活性的rFIP-gap1/2。这为树舌灵芝FIP进一步开发和实践应用提供理论依据。第二部分为rFIP-gap1/2、rLZ-8和rFIP-gsi的比较分析。人工合成LZ-8和FIP-gsi基因,构建诱导型重组表达载体pPIC9-His-LZ-8和pPIC9-His-FIP-gsi,然后转入毕赤酵母。经SDS-PAGE和Western blot结果证明LZ-8和FIP-gsi成功表达,表达量分别为133.6和124.3 mg/L。重组蛋白经组氨酸凝胶柱纯化、透析、冻干处理后获得纯化的rLZ-8和rFIP-gsi,进行体外生物学活性检测,并与rFIP-gap1/2的生物学功能进行比较分析。结果表明,当rFIP-gap1、rLZ-8和rFIP-gsi的浓度为5 μg/mL时都能够凝集人、小鼠和羊的血细胞,而rFIP-gap2在同样的浓度下却不能凝集这三种血细胞;rFIP-gap1/2、rLZ-8和rFIP-gsi(5 μg/mL)也都能够明显的促进小鼠脾淋巴细胞增殖,但作用效率不同;rLZ-8和rFIP-gsi(5 μg/mL)还能够明显地促进细胞因子IL-2和IFN-y的分泌,rLZ-8和rFIP-gsi促进脾淋细胞释放IL-2的表达量分别为524.5和236.5 pg/mL。而促进脾淋细胞释放IFN-γ的表达量分别达到了 606和1538 pg/mL;同时,采用MTT法测定rLZ-8和rFIP-gsi对A549、Hela和MCF-7三种癌细胞的抑制效果。rLZ-8在浓度为16 μg/mL时,对A549、Hela和MCF-7三种细胞抑制率分别为25.1%、33.9%和18.7%,IC50值分别为21.65、17.53和31.38 μg/mL。rFIP-gsi在浓度为16 μg/mL时,对Hela和MCF-7细胞的抑制率分别为23.7%和17.1%,而对A549、Hela和MCF-7三种细胞的IC50值分别68.04、19.44和39.89 μg/mL。rFIP-gap1/2与rLZ-8和rFIP-gsi的生物学活性比较分析,对进一步全面阐明FIP的生物学功能具有重要科学意义。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q78;S567.3

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马红霞;周忠波;包海鹰;图力古尔;李玉;;树舌灵芝中分离得到非还原性二糖—海藻糖(英文)[J];菌物学报;2008年04期
2 谭日红;张翼伸;梁忠岩;;长白山树舌水溶性多糖的研究——F_T.F_A分离纯化与结构确定[J];东北师大学报(自然科学版);1991年04期
3 梁忠岩,张翼伸,苗春艳;树舌水溶色素多糖CF_2的结构确定[J];生物化学杂志;1992年04期
4 梁忠岩,苗春艳,张翼伸,张丽萍;树舌多糖结构修饰前后CD谱比较研究[J];生物化学杂志;1995年04期
5 叶玉娣;灵芝真伪之析[J];杭州科技;2001年02期
6 梁忠岩,张翼伸,苗春艳;长白山树舌水溶性色素多糖CF_1的分离纯化与结构研究[J];生物化学杂志;1990年03期
7 李丽秋,马淑霞,杨景云,吕密凯,高艳华,车世伟;树舌中药复方煎剂对小鼠肠道菌群及体液免疫的调节作用[J];中国微生态学杂志;1997年06期
8 谭日红;张翼伸;梁忠岩;;长白山树舌水溶性多糖研究—F_B·F_C的分离纯化与结构确定[J];东北师大学报(自然科学版);1993年03期
9 梁忠岩,谭日红,张翼伸,苗春艳;树舌多糖Fb、Fc的结构研究[J];生物化学杂志;1994年04期
10 梁忠岩,张翼伸,苗春艳,张丽萍;树舌多糖CF2a溶液中构象行为的研究[J];生物化学与生物物理学报;1994年04期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 李忠谱;;野生活树树舌与栽培灵芝药效比较研究[A];中国自然资源学会全国第二届天然药物资源学术研讨会论文集[C];1997年
2 张凌凌;潘景芝;王琦;;树舌菌丝体多糖提取工艺研究[A];中国菌物学会2009学术年会论文摘要集[C];2009年
3 于英君;李丽阳;宋高臣;管宇;;树舌多糖GF注射液对环磷酰胺的增效减毒作用[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
4 刘海良;宋爱荣;黄芳;;树舌灵芝MP-01菌株发酵液灵芝酸的提取及测定[A];2008全国药用真菌学术研讨会论文集[C];2008年
5 于英君;刘春玲;;重组siRNA/CDK2对HO-8910抑制及树舌多糖GF协同作用的研究[A];现代化中药制剂发展与中药药理学研究交流会论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 曾宪策 罗欣;“树舌”岂能充“灵芝”[N];医药导报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 焦连庆;树舌多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究[D];长春中医药大学;2010年
2 于赫;树舌多糖GF对小鼠HepA瘤细胞可溶性蛋白质组及核蛋白MDM-2表达的影响[D];黑龙江中医药大学;2006年
3 于晓光;纤粘连蛋白诱导Hela细胞转移机制及树舌多糖(GF)抗肿瘤转移作用的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2003年
4 宋高臣;RNAi沉寂肝癌细胞CDK2基因表达及树舌多糖GF辅助作用的研究[D];黑龙江中医药大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 段作文;树舌灵芝FIP在毕赤酵母中的优化表达及与赤灵芝、紫芝FIP的比较[D];沈阳农业大学;2017年
2 臧金平;树舌菌株的分离、鉴定及培养研究[D];南京师范大学;2005年
3 杨颜铭;树舌多糖双向免疫调节作用的研究[D];吉林农业大学;2011年
4 林倩倩;树舌灵芝深层发酵及三萜类化合物的研究[D];吉林农业大学;2012年
5 宋高臣;树舌多糖GF注射液对化疗药物环磷酰胺增效减毒作用的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2005年
6 崔太浩;树舌多糖抗实验性胃溃疡作用及其作用机制研究[D];延边大学;2008年
7 曹艳菲;移植H_(22)小鼠血清蛋白质组及树舌多糖GF注射液对其影响的研究[D];黑龙江中医药大学;2007年
8 周忠波;树舌灵芝化学成分及体外抗肿瘤活性研究[D];吉林农业大学;2005年
9 刘小腊;树舌灵芝液体深层发酵浸膏多糖的抗肿瘤活性研究[D];吉林农业大学;2011年
10 张春玉;长白山药用真菌树舌凝集素的分离纯化及生化特性[D];东北师范大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026