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《沈阳农业大学》 2017年
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木犀草素对化脓隐秘杆菌MATE基因抑制作用的研究

宋雪娇  
【摘要】:化脓隐秘杆菌(Trueperellapyogenes)是一种可引起动物化脓性感染的重要病原菌,由于该菌耐药性迅猛发展,已受到学者广泛关注。主动外排系统的存在是导致细菌耐药性产生的重要因素之一,现存外排泵抑制剂(EPIs)虽能消减菌体对抗菌药的排出,却因为剂量高、副作用大而在临床应用中受到限制。本研究分析了化脓隐秘杆菌外排基因与其耐药相关性,并探究木犀草素对该菌外排基因的影响,以期为木犀草素作为抗菌新药的研发奠定基础,对减少化脓隐秘杆菌耐药性的产生具有重要意义。本研究通过分子生物学和生物信息学技术相结合的方法,对化脓隐秘杆菌MATE基因进行筛查;并对该基因所编码蛋白质的二级、三级结构及其保守结构域等进行预测分析。结果显示,化脓隐秘杆菌分离株中MATE基因的携带率为94.12%(32/34),该基因共编码436个氨基酸,相对分子量为44.94232 kD,理论等电点为10.05,总平均亲水性指数(GRAVY)为0.873;该转运蛋白最有可能分布于细胞膜上;不含信号肽序列、N-糖基化位点,含有12个跨膜区域、25个磷酸化位点;其二级结构是以α-螺旋为主的混合结构,含有2个保守结构域;未预测出较可靠的蛋白质三维结构。采用微量肉汤稀释法分别测定木犀草素和庆大霉素对34株化脓隐秘杆菌的最小抑菌浓度(MIC)。选取对庆大霉素耐药的化脓隐秘杆菌,通过棋盘法测定两种药物联合抑菌效果。经亚抑菌浓度木犀草素作用耐药菌株,比较木犀草素作用前后化脓隐秘杆菌对庆大霉素的耐药性变化情况。结果表明,木犀草素对化脓隐秘杆菌的MIC值为39~156 μg/mL,与庆大霉素联合的作用为不相关;耐药菌经亚抑菌浓度木犀草素(1/4MIC)作用36 h后,庆大霉素对耐药菌的MIC值下降2~32倍,且原菌株耐药水平越高,MIC下降倍数越高。提示木犀草素具有良好抗菌活性的体外抗菌活性,且能够消减化脓隐秘杆菌耐药性。选取8株携带MATE基因的耐庆大霉素化脓隐秘杆菌,通过荧光定量PCR扩增等方法,研究木犀草素对化脓隐秘杆菌MATE基因序列及其mRNA表达量的影响。结果发现,经亚抑菌浓度木犀草素(1/4MIC)作用后,对MATE基因的碱基序列没有变化,但MATE基因mRNA表达量均下降,且随着该基因mRNA表达量的下降,菌株MIC值亦呈下降趋势,但传代后变化趋势不明显。初步说明,木犀草素可能通过抑制化脓隐秘杆菌MATE基因mRNA的表达量而影响其耐药性。本研究从外排基因入手,预测并分析化脓隐秘杆菌MATE基因与其耐药相关性,探究木犀草素抑菌活性及其对化脓隐秘杆菌外排基因的影响,将对研究该菌耐药机制及延缓该菌耐药性的产生具有重要意义,同时为木犀草素作为新型抗菌药物的研发奠定基础。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.61

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